Hazırkı ünvan: OX11 0DE, Böyük Britaniya, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Böyük Britaniya, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektron Bioloji Görüntüləmə Mərkəzi.
Reaksiya mərkəzinin işıq yığımı kompleksi 1 (RC-LH1) bənövşəyi fototrof bakteriyaların əsas fotosintetik komponentidir. Rhodopseudomonas palustris-dən RC-LH1 kompleksinin iki krio-elektron mikroskopiya strukturunu təqdim etdik. RC-LH114-W kompleksinin 2.65-Å qətnamə strukturu, RC-ni əhatə edən 14 alt vahid LH1 ilgəyindən ibarətdir və bu ilmə W zülalı ilə kəsilir, zülal-W olmayan kompleks isə tamamilə RC ilə əhatə olunmuş RC tərkibidir. Bağlı 16 alt vahid LH1 ilgəyi. Bu strukturların müqayisəsi, RC-LH1 kompleksindəki xinonun dinamikası, o cümlədən RC QB yerində xinonun bağlanması zamanı əvvəllər müəyyən edilməmiş konformasiya dəyişiklikləri, eləcə də onların RC-yə ötürülməsinə kömək edən köməkçi xinon bağlanma yerlərinin yeri haqqında məlumat verir. W zülalının unikal strukturu LH1 ilgəyinin bağlanmasının qarşısını alır və bununla da xinon/xinolon mübadiləsini sürətləndirmək üçün bir kanal yaradır.
Fotosintezin verdiyi enerji, demək olar ki, bütün həyatı təmin edə bilər və günəş biotexnologiyası üçün böyük potensiala malikdir. Qlobal fotosintezi təşviq edərkən, bənövşəyi fototrof bakteriyalar həmçinin müxtəlif enerji rejimləri və metabolik qabiliyyətlər nümayiş etdirirlər. Onlar fotosintezdən yayınaraq qaranlıqda heterotrof bakteriyalar kimi böyüyə, azot və karbon qazını fiksasiya edə, hidrogen istehsal edə və aromatik birləşmələri parçalaya bilərlər (1-3). Bu proseslər üçün enerji təmin etmək üçün işıq tez və səmərəli şəkildə kimyəvi enerjiyə çevrilməlidir. Bu proses işıq tutan antenna kompleksi işığı udanda və tutulan enerjini reaksiya mərkəzinə (RC) ötürəndə başlayır və bununla da yük ayrılmasına başlayır (4-7). Bənövşəyi fototrof bakteriyalarda fotosintezin əsas vahidi, işıq yığan kompleks 1 (LH1) ilə əhatə olunmuş 2-ci tip RC-dən ibarətdir və RC-LH1 əsas kompleksini əmələ gətirir. LH1, hər biri iki bakterial xlorofil (BChl) a molekuluna və bir və ya iki karotinoidə (8-12) bağlanan əyri αβ heterodimerlər massivi ilə əmələ gəlir. Ən sadə LH1 antenası, RC-ni (9-13) qapalı bir dövrədə əhatə edən 16 və ya 17 αβ heterodimerdən ibarətdir, lakin digər əsas komplekslərdə transmembran peptidləri ətrafdakı LH1-in davamlılığını pozur və bununla da RC və sitoxrom bc1 kompleksi arasında xinol/xinon diffuziyasını təşviq edir (11, 13-15). Bənövşəyi fototrofik bitki Rhodopseudomonas (Rps.), fotosintezi dəstəkləyən enerji və elektron ötürülməsini başa düşə bilən model orqanizmdir. Rps-in ilk kristal quruluşu. Palustris RC-LH1 kompleksinin modeli, "Protein W" adlı naməlum bir zülal tərəfindən kəsilən 15 heterodimerik LH1 ilgəyi ilə əhatə olunmuş RC-dir (14). Protein-W sonradan üç proqnozlaşdırılan transmembran spiralına (TMH) malik xarakterik olmayan 10,5 kDa zülal olan RPA4402 kimi müəyyən edildi (16). RC-L, M (pufL, pufM) və LH1α, β (pufA, pufB) alt vahidlərini kodlayan genlər üçün istifadə olunan nomenklatura ilə uyğunlaşmaq üçün W zülalını kodlayan rpa4402 geninin adını pufW olaraq dəyişdirməyi təklif edirik. Maraqlıdır ki, W zülalı RC-LH1-in yalnız təxminən 10%-də mövcuddur və bu da Rps. palustrisin iki fərqli RC-LH1 kompleksi istehsal etdiyini göstərir. Burada iki əsas kompleksin, biri W zülal və 14 αβ heterodimerli, digəri isə W zülalı və qapalı 16 Heterodimer LH1 döngəsi olmayan yüksək qətnaməli krio-EM (krio-EM) strukturlarını təqdim edirik. Strukturumuz, hər variantın homogen populyasiyasını təhlil etdiyimiz və hər bir peptid və bağlı piqmentləri, eləcə də əlaqəli lipidləri və xinonları aydın şəkildə təyin etmək üçün kifayət qədər qətnaməyə malik olduğumuz üçün Rps. palustrisin RC-LH1 kompleksinin anlaşılmasında mərhələli bir dəyişikliyi təmsil edir. Bu strukturların müqayisəsi göstərir ki, indiyə qədər heç bir başqa RC-LH1 kompleksində tapılmayan üç TMH zülalı-W, xinon/xinolon mübadiləsini sürətləndirmək üçün xinon kanalı yaradır. Bir sıra qorunan lipid və xinon bağlanma yerləri müəyyən edilmişdir və biz xinon və RC-nin birləşməsindən sonra yeni bir konformasiya dəyişikliyi aşkar etdik ki, bu da oksigenli fototrof orqanizmlərin fotosistem II (PSII) RC-si üçün uyğun ola bilər. Tapıntılarımız bənövşəyi fototrof bakteriyaların RC-LH1 əsas kompleksində xinon/xinolon bağlanması və mübadiləsinin kinetikasına yeni anlayışlar verir.
Rps. palustris-də tapılan iki kompleksin ətraflı öyrənilməsini asanlaşdırmaq üçün hər bir RC-LH1-i biokimyəvi üsullarla təcrid edirik. Zülal W-çatışmazlıq kompleksi (bundan sonra ΔpufW adlanacaq) pufW genindən məhrum olan ştammdan təmizlənmişdir (16) və yalnız bir RC-LH1 kompleksi istehsal edilə bilər. Zülal W tərkibli kompleks bir ştamm tərəfindən istehsal olunur. Bu ştammın W zülalı C-terminalında 10x His etiketi ilə modifikasiya olunur ki, W tərkibli protein kompleksi metalı immobilizasiya etməklə əksər çatışmayan W proteini ilə effektiv şəkildə birləşdirilə bilsin. Kompleks effektiv şəkildə ayrılır (16) Affinity Xromatoqrafiyası (IMAC).
Şəkil 1-də göstərildiyi kimi, hər iki kompleks LH1 antena ilə əhatə olunmuş üç alt vahid RC (RC-L, RC-M və RC-H) ehtiva edir. Zülal-W olmayan kompleksin 2.80-A strukturu, bundan sonra RC-LH116 kompleksi adlandırılacaq, tamamilə RC-ni əhatə edən qapalı LH1 döngəsi əmələ gətirən 16 αβ heterodimer göstərir. Zülal-W tərkibli kompleksin 2.65Å strukturu, bundan sonra RC-LH114-W adlandırılacaq, protein-W tərəfindən kəsilmiş 14-heterodimer LH1-ə malikdir.
(A və B) Birləşmənin səth təsviri. (C və D) Çubuqlarda ifadə olunan birləşmiş piqmentlər. (E və F) Sitoplazmatik səthdən müşahidə edilən komplekslər cizgi filmlərində təmsil olunan peptidlərə və LH1 alt vahidlərinə malikdir və zülal-W boşluğundan saat əqrəbi istiqamətində nömrələnir [Rba nömrələnməsinə uyğundur. sphaeroides kompleksi (13)]. LH1-α üçün zülal alt vahidinin rəngi sarıdır; LH1-β üçün zülal alt vahidinin rəngi mavidir; zülal-W üçün zülal qırmızıdır; RC-H üçün mavidir; RC-L üçün narıncıdır; RC-M üçün magentadır. Kofaktorlar çubuqlarla, yaşıl BChl və BPh a molekullarını, bənövşəyi karotinoidləri, sarı isə UQ10 molekullarını təmsil edir. (G və H) RC-LH114-W kompleksinin (G) və RC-LH116 kompleksinin (H) ekvivalent bölgəsində zülal-W boşluğunun böyüdülmüş görünüşü. Kofaktorlar boşluq doldurma şəklində, xelatlanmış xinon mavi rəngdə göstərilir. Zülal-W boşluğu (G)-də mavi kəsikli xətt ilə, xinon/xinololun LH116 halqasında yayıldığı kiçik dəliklər isə (H)-də qara kəsikli xətt ilə vurğulanır.
Şəkil 1 (A və B) hər biri iki BChl və bir karotenoidə bağlanan açıq və ya qapalı LH1αβ heterodimer massivləri ilə əhatə olunmuş RC-ni göstərir (Şəkil 1, C və D). Əvvəlki tədqiqatlar Rps-in LH1 kompleksi olduğunu göstərmişdir. Spirulina ksantinin biosintetik yolunda bu növlər karotenoidlərin qarışıq populyasiyalarını ehtiva edir (17). Lakin, spiropirroksantin dominant karotenoiddir və onun sıxlığı qənaətbəxşdir. Buna görə də, bütün LH1 bağlanma yerlərində spiroksantini modelləşdirməyi seçdik. Alfa və beta polipeptidləri qısa membran xarici bölgələri olan tək TMH-lərdir (Şəkil 1, A, B, E və F). C-terminalında 17 qalığın sıxlığı müşahidə edilməsə də, alfa polipeptid hər iki kompleksdə Met1-dən Ala46-ya bölünmüşdür. RC-LH116-da β polipeptidi Gly4-dən Tyr52-yə, RC-LH114-W-də isə Ser5-dən Tyr52-yə reduksiya olunmuşdur. 3 və ya 4 N-terminal və ya 13 C-terminal qalıqlarının sıxlığı müşahidə edilməmişdir (Şəkil S1). Vəhşi tip ştammdan hazırlanmış qarışıq RC-LH1 kompleksinin kütlə spektrometriyası təhlili göstərmişdir ki, itkin bölgə bu peptidlərin heteroloji parçalanmasının nəticəsidir (Şəkil S1 və S2). α-Met1-in N-terminal formilləşməsi də müşahidə edilmişdir (f). Təhlil göstərdi ki, α-peptid fMet1-dən Asp42/Ala46/Ala47/Ala50-yə qədər qalıqlardan, β-peptid isə Ser2-dən Ala53-ə qədər qalıqlardan ibarətdir ki, bu da aşağı temperaturlu EM sıxlığı xəritəsi ilə yaxşı uyğunluq təşkil edir.
α-His29 və β-His36-nın koordinasiyası BChl-ləri üz-üzə qoyur; hər bir αβ heterodimeri qonşuları ilə birləşərək RC ətrafında açıq ilgək (RC-LH114-W) və ya qapalı ilgək (RC-LH116) əmələ gətirir. Eksitonla əlaqəli piqment massivi (Şəkil 1, C və D). RC-LH114-W-nin 877 nm zolağı ilə müqayisədə RC-LH116-nın 880 nm udma qırmızı sürüşməsi 3 nm-dir (Şəkil 2A). Lakin dairəvi dixroizm spektri demək olar ki, eynidir (Şəkil 2B), bu da açıq və qapalı ilgəklər arasında aydın fərq olsa da, BChl-lərin yerli mühitinin çox oxşar olduğunu göstərir. Udma qırmızı sürüşməsi qapalı ilgəkdə azalmış istilik hərəkəti və artan sabitliyin (18, 19), qapalı ilgəkdən qaynaqlanan piqment birləşməsindəki dəyişiklik (20, 21) və ya bu iki təsirin kombinasiyasının (11) nəticəsi ola bilər.
(A) Ultrabənövşəyi/görünən/yaxın infraqırmızı udma spektri, zirvələri müvafiq piqmentləri ilə işarələnmiş və 775 nm-də BPh pikinə normallaşdırılmışdır. (B) Dairəvi dixroizm spektri 805 nm-də BChl udmaya normallaşdırılmışdır. (C və D) RC-LH114-W kompleksinin (C) və RC-LH116 kompleksinin (D) zamanla həll olunan udma spektrlərindən seçilmiş ΔA spektrləri. Daha yaxşı müqayisə üçün bütün spektrlər 0,2 ps-də −A-nın ∆A-sına normallaşdırılmışdır. (E) Müxtəlif UQ2 konsentrasiyalarının iştirakı ilə şüalanmadan sonra sitoxrom c2 oksidləşmə sürəti (xam məlumatlar üçün Şəkil S8-ə baxın). (F) Aşağı, orta və ya yüksək intensivlikli işıq altında yetişdirilən hüceyrələrdə (müvafiq olaraq 10, 30 və ya 300μMm-2 s-1), təmizlənmiş kompleksdəki W və RC-L alt vahidləri və ayrılmış membran nisbəti. Zülal səviyyəsini SDS-poliakrilamid gel elektroforezi və immunoanaliz yolu ilə təyin edin (xam məlumatlar üçün Şəkil S9-a baxın). Təmizlənmiş RC-LH114-W kompleksinə nisbəti təyin edin. Kompleksin RC-L-nin zülal-W-yə stexiometrik nisbəti 1:1-dir.
RC-LH114-W-nin deformasiya olunmuş αβ14 döngəsindəki 1-ci mövqedəki BChl-lər (Şəkil 1, A, C və E) RC-LH116-dakı ekvivalent BChl-lərdən RC ilkin donoruna (P) 6.8Å daha yaxındır (Şəkil 1, B, D və F və Şəkil S3); lakin, iki kompleksin keçici udma kinetikası göstərir ki, RC-LH114-W və RC-LH116 üçün LH1-dən RC-yə həyəcanlanma enerjisi ötürmə vaxt sabitləri 40 ±4 və 44±3 ps-dir (Şəkil 2). , C və D, Şəkil S4 və Cədvəl S2). RC daxilində elektron ötürmədə də əhəmiyyətli bir fərq yoxdur (Şəkil S5 və əlaqəli əlavə mətn). Şübhələnirik ki, LH1 və RC-P arasındakı enerji ötürmə vaxtının yaxın uyğunluğu iki LH1 döngəsindəki əksər BChl-lərin oxşar məsafəsi, bucağı və potensial enerjisi ilə əlaqədardır. Görünür, minimum məsafəyə çatmaq üçün LH1 enerji modelini araşdırmaq, suboptimal yerlərdən RC-yə birbaşa enerji ötürülməsindən daha sürətli deyil. RC-LH114-W-dəki açıq dövrəli LH1 döngəsi struktur təhlili üçün aşağı temperatur şəraitində əhəmiyyətsiz istilik hərəkətinə də məruz qala bilər və RC 1 mövqeyindəki βBChls-in piqmentasiya məsafəsindən otaq temperaturunda daha uzun αβ14 halqa konformasiyası mövcuddur.
RC-LH116 kompleksi 32 BChl və 16 karotenoid ehtiva edir və ümumi düzülüşü Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Zülal Məlumat Bankı (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 ştammından (PDB ID 7C9R) (12) və yaşıl yosunlardan (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) əldə edilən düzülüşlə eynidir. Düzəldildikdən sonra αβ heterodimerlərinin, xüsusən də 1-5, 15 və 16-nın mövqelərində yalnız kiçik sapmalar müşahidə edildi (Şəkil S6). Zülal-W-nin olması LH1-in strukturuna əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərir. Onun üç TMH-si qısa ilgəklərlə birləşir, N-terminal kompleksin lümen tərəfində, C-terminal isə sitoplazmatik tərəfdədir (Şəkil 1A və 3, A-dan D-yə qədər). Protein-W əsasən hidrofobdur (Şəkil 3B) və TMH2 və TMH3 transmembran səthi əmələ gətirmək üçün LH1αβ-14 ilə qarşılıqlı təsir göstərir (Şəkil 3, B və E-dən G-yə). İnterfeys əsasən transmembran bölgəsindəki Phe, Leu və Val qalıqlarından ibarətdir. Bu qalıqlar hidrofob amin turşuları və αβ-14 piqmentləri ilə üst-üstə yığılmışdır. Bəzi polyar qalıqlar da qarşılıqlı təsirə kömək edir, o cümlədən kompleks boşluğun səthində W-Thr68 və β-Trp42 arasındakı hidrogen rabitəsi (Şəkil 3, F və G). Sitoplazmanın səthində Gln34 αβ-14 karotenoidlərinin keto qrupuna bitişikdir. Bundan əlavə, n-dodesil β-d-maltozid (β-DDM) molekulu həll edildi və onun hidrofob quyruğu protein-W və αβ-14 arasındakı interfeysə qədər uzandı və lipid quyruğu bədəndə yerləşə bilər. Həmçinin W zülalının və RCH-nin C-terminal həllolma bölgələrinin çox yaxın olduğunu, lakin spesifik qarşılıqlı təsirlər yaratmaq imkanları daxilində olmadığını müşahidə etdik (Şəkil 1, A və E). Bununla belə, bu iki zülalın həll olunmamış C-terminal amin turşularında qarşılıqlı təsirlər ola bilər ki, bu da RC-LH114-W kompleksinin yığılması zamanı zülal-W-nin cəlb olunması üçün mexanizm təmin edə bilər.
(A) LH1αβ14 ilə sərhədə cizgi filmi şəklində baxan Zülal-W, elektrostatik potensial diaqramının bir hissəsində (kontur səviyyəsi 0,13 olan şəffaf boz səth) göstərilən çubuq formalı yan zəncirə (qırmızı) malikdir. (B) Hidrofob rəngli səthlə təmsil olunan Zülal-W. Qütb və yüklü sahələr firuzəyi rəngdə, hidrofob sahələr ağ rəngdə, güclü hidrofob sahələr isə narıncı rəngdə göstərilir. (C və D) Zülal-W cizgi filmində təmsil olunur, onun istiqaməti (A) (C)-dəki ilə eynidir və 180° (D) bucaq altında fırlanır. Ardıcıllıqdakı mövqeyə görə, fərqlənən qalıqlar göy qurşağı rəng sxemini qəbul edir, burada N-terminal mavi, C-terminal isə qırmızıdır. (E) (A)-dakı ilə eyni görünüşdə olan Zülal-W və protein-W:LH1 sərhədindəki qalıqlar əlavə işarələri olan çubuqlarla təmsil olunur. (F) Zülal-W cizgi filmində (E) və LH1αβ14-ə nisbətən 90°, sütun təsvirində isə interfeys qalıqlarına nisbətən fırlanır. Beta polipeptidindən çıxan qalıqlar etiketlənir. Kofaktor Şəkil 1-in rənginə uyğun sütun, parçalanmış β-DDM boz rəngdə, oksigen isə qırmızı rəngdə göstərilir. (G) (F)-dəki görünüş etiketlənmiş alfa polipeptidinin qalıqları ilə 180° fırlanır.
Protein-W, αβ heterodimerini (Şəkil 1F-də 15-ci) əvəz edir və bununla da ilgəyin bağlanmasının qarşısını alır və ilk üç αβ heterodimerini əyir. Müşahidə edilmişdir ki, birinci αβ-1 heterodimerinin film normalına nisbətən maksimum meyl bucağı 25°-dən 29°-yə qədərdir (Şəkil 1, A və E), bu da RC A kəskin kontrastlı-LH116-da αβ-1-in 2°-dən 8°-yə qədər meyllənməsi ilə əmələ gəlmişdir (Şəkil 1, B və F). İkinci və üçüncü heterodimerlər müvafiq olaraq 12°-dən 22°-yə və 5°-dən 10°-yə qədər meyllidirlər. RC-nin sterik maneəsinə görə, αβ-1-in meylinə ikinci αβ cütü daxil deyil (Şəkil 1F-də 16-cı αβ-yə uyğun gəlir), beləliklə LH1 halqasında aydın bir boşluq əmələ gətirir (Şəkil 1, A və E). İki αβ heterodimerinin olmaması, dörd BChl və iki karotenoidin itirilməsi ilə müşayiət olunması səbəbindən, karotenoidlərin heç biri bükülmüş αβ-1 alt vahidinə bağlanmır və nəticədə 13 Vegetarian və 28 BChl karotenoidi olan LH114-W halqası əmələ gəlir. αβ1-dən 7-yə qədər bölgələrdəki iki kompleksin lokal qətnamə qiymətləndirmələri LH1 döngəsinin qalan hissəsindən daha aşağıdır ki, bu da RC QB sahəsinə bitişik LH1 alt vahidinin daxili plastikliyini əks etdirə bilər (Şəkil 4).
RC-LH114-W (A və B) və RC-LH116 (C və D) şəkilləri Şəkil 1-dəki (B və D) eyni yuxarıdan/yandan görünüşdən (A və B) (A və C) və boşluq səthindən göstərilir. Rəngli düymələr sağda göstərilir.
1:14 stexiometrik nisbətinə malik yeganə xarakterik nüvə kompleksi Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeridir (13). Lakin, W və PufX zülallarının heç bir aşkar homologiyası yoxdur və müvafiq LH1 strukturlarına əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərir. PufX, RC-H alt vahidinin (13) sitoplazmatik tərəfi ilə Rps. palustris LH116αβ-16-ya uyğun bir mövqedə qarşılıqlı təsir göstərən N-terminal sitoplazmatik domeni olan tək bir TMH-dir. PufX, RC-LH1 və sitoxrom bcl kompleksi arasında xinon/xinolon mübadiləsi üçün bir kanal yaradır və bütün Rba.sphaeroides nüvə kompleksində mövcuddur (13). Monomer-monomer interfeysi Rba-da olsa da. RC-LH1-PufX dimeri olan sfaeroidlər RC-LH114-W-də W zülalının bağlanma mövqeyində yerləşir və PufX və W zülalının yaratdığı boşluq ekvivalent mövqedədir (Şəkil S7A). RC-LH114-W-dəki boşluq həmçinin W və ya PufX zülalları ilə əlaqəli olmayan peptidlər tərəfindən əmələ gələn Pseudomonas rosea LH1-in hipotetik xinon kanalı (8) ilə uyğunlaşdırılıb (Şəkil S7B). Bundan əlavə, Blc-dəki xinon kanalı. Bir γ alt vahidinin (7) xaric edilməsi ilə əmələ gələn zümrüd yaşıl LH1 oxşar mövqedə yerləşir (Şəkil S7C). Müxtəlif zülallar tərəfindən vasitəçilik edilsə də, bu xinon/xinolol kanallarının RC-LH1 kompleksində ortaq bir mövqedə görünməsi konvergent təkamülün nümunəsi kimi görünür və W zülalının yaratdığı boşluğun xinon kanalı kimi çıxış edə biləcəyini göstərir.
LH114-W döngəsindəki boşluq, zülallarda olduğu kimi iki domeni zülal məsaməsi vasitəsilə birləşdirmək əvəzinə, RC-LH114-W kompleksinin daxili boşluğu ilə toplu membran arasında davamlı bir membran bölgəsinin əmələ gəlməsinə imkan verir (Şəkil 1G). RC-LH116 kompleksi qapalı Tch. İynəyəbənzər kompleksə bənzəyir (22) (Şəkil 1H). Xinonun membran vasitəsilə diffuziyası dar zülal kanalı vasitəsilə diffuziyadan daha sürətli olduğundan, açıq LH114-W döngəsi qapalı LH116 döngəsinə nisbətən daha sürətli RC dövriyyəsinə imkan verə bilər və xinonun RC-yə diffuziyası daha məhdud ola bilər. W ​​zülalının RC vasitəsilə xinonların çevrilməsinə təsir edib-etmədiyini yoxlamaq üçün müəyyən bir konsentrasiyada ubikinon 2 (UQ2) (daha qısa izopren quyruğu olan təbii UQ10-un analoqu) üzərində sitoxrom oksidləşmə analizi apardıq (Şəkil 2E). Şelatlı xinonun olması görünən Mixaelis sabitinin dəqiq təyin olunmasına mane olsa da (RC-LH114-W və RC-LH116 müvafiq olaraq 0,2±0,1μM və 0,5±0,2μM üçün uyğundur), RC-LH114-W-nin maksimum sürəti (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) RC-LH116-dan (3,6±0,1 e-RC-1 s-1) 28±5% daha böyükdür.
Əvvəlcə protein-W-nin əsas kompleksin təxminən 10%-də mövcud olduğunu təxmin etdik (16); burada az işıqlı, orta işıqlı və yüksək işıqlı böyümə hüceyrələrinin dolma nisbətləri müvafiq olaraq 15±0.6%, 11±1% və 0.9±0.5% təşkil edir (Şəkil 2F). Kütlə spektrometriyasının kəmiyyət müqayisəsi göstərdi ki, histidin etiketinin əlavə edilməsi vəhşi tip ştammlarla müqayisədə protein-W-nin nisbi bolluğunu azaltmayıb (P = 0.59), buna görə də bu səviyyələr modifikasiya olunmuş protein-W-nin artefaktı deyil (Şəkil S10). Lakin, RC-LH1 kompleksində protein-W-nin bu aşağı dolması bəzi RC-lərin sürətlənmiş sürətlə fırlanmasına imkan verə bilər və bununla da RC-LH116 kompleksində daha yavaş xinon/xinolon mübadiləsini azaldır. Yüksək işıqda dolma nisbətinin son transkriptomika məlumatları ilə uyğunsuz olduğunu gördük ki, bu da güclü işıq altında pufW gen ifadəsinin artdığını göstərir (Şəkil S11) (23). pufW transkripsiyası ilə protein-W-nin RC-LH1 kompleksinə daxil edilməsi arasındakı fərq çaşdırıcıdır və zülalın mürəkkəb tənzimlənməsini əks etdirə bilər.
RC-LH114-W-də 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilqliserol (POPG) və 29 β-DDM molekulu ayrılmış və modelləşdirilmişdir: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG və 12 βDDM. RC-LH116 (Şəkil 5, A və B). Bu iki strukturda CDL demək olar ki, kompleksin sitoplazmatik tərəfində, POPC, POPG və β-DDM isə əsasən lüminal tərəfdə yerləşir. RC-LH114-W kompleksinin αβ-1 - αβ-6 bölgəsində iki lipid və yuyucu vasitə molekulu təcrid olunmuşdur (Şəkil 5A), beşi isə RC-LH116-nın ekvivalent bölgəsində təcrid olunmuşdur (Şəkil 5B). Kompleksin digər tərəfində, əsasən CDL-də, RC və αβ-7 ilə αβ-13 arasında toplanan daha çox lipid aşkar edilmişdir (Şəkil 5, A və B). Digər struktur olaraq həll olmuş lipidlər və yuyucu maddələr LH1 halqasının xaricində yerləşir və yaxşı həll olmuş asil zəncirləri LH1 alt vahidləri arasında uzanır, RC-LH114-W-də şərti olaraq β-DDM kimi təyin olunur və β-DDM və POPC-LH116-nın RC A qarışığında β-DDM kimi təyin olunur. Xelatlaşdırıcı lipidlərin və yuyucu maddələrin strukturumuzdakı oxşar mövqeləri onların fizioloji cəhətdən əhəmiyyətli bağlanma yerləri olduğunu göstərir (Şəkil S12A). Tch-dəki ekvivalent molekulların mövqeləri də yaxşı konsistensiyaya malikdir. Zərif və Trv. 970 RC-LH1s ştammı (Şəkil S12, B-dən E-yə) (9, 12) və lipid başlıq qrupunun hidrogen rabitə qalıqları ardıcıllıq uyğunlaşmasında kifayət qədər yaxşı qorunma göstərdi (Şəkil S13), bu da RC-yə bağlanan CDL-in (24) qorunub saxlanıldığını göstərir, bu sahələr RC-LH1 kompleksində qorunub saxlanıla bilər.
(A və B) RC-LH114-W (A) və RC-LH116 (B) peptidləri Şəkil 1-dəki rəng sxemindən istifadə edərək cizgi filmləri, piqmentlər isə çubuqlarla təmsil olunur. Lipidlər qırmızı, yuyucu vasitələr isə boz rəngdə göstərilir. RC QA və QB sahələrinə bağlı UQ sarı, təcrid olunmuş UQ isə mavi rəngdədir. (C və D) (A) və (B) ilə eyni görünüşlər, lipidlər buraxılmışdır. (E-dən G-yə) RC-LH116-dan bir-birinə təsir edən yan zəncirlərlə Q1(E), Q2(F) və Q3(G)-nin böyüdülmüş görünüşü. Hidrogen rabitələri qara kəsikli xətlər kimi göstərilir.
RC-LH116-da, yük ayrılması prosesində elektron ötürülməsində iştirak edən həm RC QA, həm də QB UQ bağlanma yerlərində parçalanır. Lakin, RC-LH114-W-də QB xinon həll olunmayıb və aşağıda ətraflı müzakirə olunacaq. QA və QB xinonlarına əlavə olaraq, iki xelatlanmış UQ molekulu (RC və LH1 halqaları arasında yerləşir) RC-LH114-W strukturunda yaxşı həll olunmuş baş qruplarına (müvafiq olaraq Q1 və Q2-də yerləşir) görə ayrılmışdır. boşluq). Şəkil 5C). Q1-ə iki izopren vahidi təyin edilmişdir və sıxlıq xəritəsi Q2-nin tam 10 izopren quyruğunu həll edir. RC-LH116 strukturunda üç xelatlanmış UQ10 molekulu (Q1-dən Q3-ə, Şəkil 5D) həll edilmişdir və bütün molekullar quyruq boyunca aydın bir sıxlığa malikdir (Şəkil 5, D-dən G-yə). İki strukturda Q1 və Q2-nin xinon baş qruplarının mövqeləri əla tutarlılığa malikdir (Şəkil S12F) və onlar yalnız RC ilə qarşılıqlı təsir göstərir. Q1, RC-LH114-W-nin W boşluğunun girişində yerləşir (Şəkil 1G və 5, C, D və E), Q2 isə QB bağlanma yerinin yaxınlığında yerləşir (Şəkil 5, C, D) və F). Qorunan L-Trp143 və L-Trp269 qalıqları Q1 və Q2-yə çox yaxındır və potensial π-yığma qarşılıqlı təsirləri təmin edir (Şəkil 5, E və F, və Şəkil S12). Q1-in distal oksigenindən 3.0 Å ayrılan L-Gln88 güclü hidrogen rabitəsi təmin edir (Şəkil 5E); bu qalıq ən uzaq əlaqə istisna olmaqla, bütün RC-lərdə qorunur (Şəkil S13). L-Ser91 əksər digər RC-lərdə Thr-in yerinə konservativ şəkildə yerləşdirilir (Şəkil S13), Q1-in metil oksigenindən 3,8 Anqstromdur və zəif hidrogen rabitələri təmin edə bilər (Şəkil 5E). Q3-ün spesifik qarşılıqlı təsiri yoxdur, lakin RC-M alt vahidi ilə LH1-α 5-6 alt vahidi arasındakı hidrofob bölgədə yerləşir (Şəkil 5, D və G). Q1, Q2 və Q3 və ya yaxınlıqdakı xelatlı xinonlar da Tch. Gentle, Trv. Strain 970 və Blc-də həll edilmişdir. İris strukturu (9, 10, 12) RC-LH1 kompleksində qorunan köməkçi xinon bağlanma yerinə işarə edir (Şəkil S12G). RC-LH116-dakı beş parçalanmış UQ, yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası (HPLC) ilə müəyyən edilən hər bir kompleksin 5.8±0.7 ilə yaxşı uyğunluq təşkil edir, RC-LH114-W-dəki üç parçalanmış UQ isə 6.2±0.3 ölçülmüş dəyəri (Şəkil S14) strukturda həll olunmamış UQ molekullarının olduğunu göstərir.
Psevdo-simmetrik L və M polipeptidlərinin hər biri beş TMH ehtiva edir və bir BChl dimerini, iki BChl monomerini, iki bakteriofaq (BPh) monomerini və bir qeyri-Hem dəmirini və bir və ya iki UQ10 molekulunu birləşdirən heterodimer əmələ gətirir. Terminal keton qrupunda hidrogen rabitələrinin olması və Rps-də məlum toplanması sayəsində karotenoidlər cis-3,4-dehidroorhodopin adlanan M-alt vahidinə daxil edilir. Növlər (25). RC-H-nin xarici membran domeni membrana tək bir TMH ilə bərkidilir. Ümumi RC strukturu əlaqəli növlərin (məsələn, Rba) üç alt vahidi RC-yə bənzəyir. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl və BPh makrosiklləri, karotenoid onurğası və qeyri-hem dəmiri, QA sahəsindəki UQ10 baş qrupu və RC-LH116-dakı QB xinonu kimi bu strukturların qətnamə diapazonunda üst-üstə düşür (Şəkil S15).
Fərqli QB sahəsindəki dolma nisbətlərinə malik iki RC strukturunun mövcudluğu, QB xinon bağlanması ilə müşayiət olunan ardıcıl konformasiya dəyişikliklərini araşdırmaq üçün yeni bir fürsət yaradır. RC-LH116 kompleksində QB xinon tam bağlı "proksimal" mövqedə yerləşir (26), lakin RC-LH114-W-nin ayrılmasında QB xinon yoxdur. RC-LH114-W-də QB xinon yoxdur, bu da təəccüblüdür, çünki kompleks struktur olaraq həll edilmiş QB xinonlu RC-LH116 kompleksindən daha çox aktivdir. İki LH1 halqası təxminən altı xinon xelatlasa da, beşi qapalı RC-LH116 halqasında struktur olaraq həll olunur, yalnız üçü isə açıq RC-LH114-W halqasında struktur olaraq məhduddur. Bu artan struktur pozğunluğu RC-LH114-W QB sahələrinin daha sürətli dəyişdirilməsini, kompleksdə daha sürətli xinon kinetikasını və LH1 döngəsini keçmə ehtimalının artması ilə nəticələnə bilər. Biz RC-LH114-W-nin RC QB sahəsində UQ-nun olmamasının daha mürəkkəb və daha aktiv kompleksin nəticəsi ola biləcəyini və RC-LH114-W-nin QB sahəsinin dərhal UQ dövriyyəsində donduğunu düşünürük. Xüsusi mərhələ (QB sahəsinə giriş bağlanıb) bu ​​aktivliyin konformasiyasını əks etdirir.
QB olmadan, L-Phe217-nin UQ10 bağlanması ilə uyğun olmayan bir mövqeyə fırlanması, çünki bu, quyruğun ilk izopren vahidi ilə fəza toqquşmasına səbəb olacaq (Şəkil 6A). Bundan əlavə, aşkar əsas konformasiya dəyişiklikləri, xüsusən də L-Phe217-nin QB bağlanma cibinə köçürüldüyü de heliksi (TMH D və E arasındakı döngədə qısa heliks) və L-Tyr223-ün fırlanması (Şəkil 6A) M-Asp45 çərçivəsi ilə hidrogen rabitəsini qırmaq və QB bağlanma yerinin girişini bağlamaq üçün (Şəkil 6B). Heliks de öz bazasında fırlanır, L-Ser209-un Cα 0.33Å, L-Val221Cα isə 3.52Å sürüşür. TMH D və E-də hər iki strukturda üst-üstə düşən müşahidə edilə bilən dəyişikliklər yoxdur (Şəkil 6A). Bildiyimiz qədəri ilə, bu, təbii RC-də QB sahəsini bağlayan ilk strukturdur. Tam (QB ilə əlaqəli) strukturla müqayisə göstərir ki, xinon reduksiya olunmazdan əvvəl onun xinona daxil olması üçün konformasiya dəyişikliyi tələb olunur. L-Phe217 xinon baş qrupu ilə π-yığma qarşılıqlı təsiri yaratmaq üçün fırlanır və spiral xaricə doğru sürüşür, bu da L-Gly222 skeletinin və L-Tyr223-ün yan zəncirinin sabit hidrogen rabitə strukturuna malik hidrogen rabitə şəbəkəsi yaratmasına imkan verir (Şəkil 6, A və C).
(A) Əsas qalıqların çubuqvari təsvir şəklində göstərildiyi holoqram (L zənciri, narıncı/M zənciri, bənövşəyi) və apo (boz) strukturunun üst-üstə düşən karikaturası. UQ10 sarı zolaqla təmsil olunur. Nöqtəli xətt bütün strukturda əmələ gələn hidrogen rabitələrini göstərir. (B və C) Apolipoproteinin və bütün halqa strukturunun səth təsviri, müvafiq olaraq mavi rəngdə L-Phe217 və qırmızı rəngdə L-Tyr223-ün yan zəncir oksigenini vurğulayır. L alt vahidi narıncıdır; M və H alt vahidləri rənglənməyib. (D və E) Apolipoprotein (D) və bütöv (E) RC QB sahələri [müvafiq olaraq (A) ilə rəngləyin] və Thermophilus thermophilus PSII (yaşıl, plastik xinonlu mavi; PDB ID: 3WU2) Düzləşdirin (58).
Gözlənilmədən, LH1 olmadan QB çatışmazlığı olan RC-lərin bir neçə strukturu mövcud olsa da, bu tədqiqatda müşahidə edilən konformasiya dəyişiklikləri əvvəllər bildirilməmişdir. Bunlara Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) və Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29)-dan QB tükənməsi strukturu daxildir ki, bunların hamısı ümumi QB strukturu ilə demək olar ki, eynidir. 3PRC-nin yaxından yoxlanılması LDAO (Lauril Dimetil Amin Oksid) yuyucu maddə molekullarının QB mövqeyinin girişində bağlandığını və bu da qapalı konformasiyaya çevrilməsinin qarşısını ala biləcəyini göstərdi. LDAO 1EYS və ya 1OGV-də eyni mövqedə parçalanmasa da, bu RC-lər eyni yuyucu vasitədən istifadə edilərək hazırlanır və buna görə də eyni effekti verə bilər. Rba-nın kristal quruluşu. Sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) ilə birgə kristallaşan Sphaeroides RC də qapalı QB sahəsinə malikdir. Lakin, bu halda, RC-M polipeptidinin N-terminal bölgəsi (Q spiralındakı Tyr qalığının H rabitəsi vasitəsilə QB bağlanma sahəsi ilə qarşılıqlı təsir göstərir) qeyri-təbii bir konformasiya qəbul edir və QB konformasiya dəyişikliyi daha da araşdırılmır (30). Təsəlliverici odur ki, RC-LH114-W strukturunda M polipeptidinin bu cür deformasiyasını görməmişik ki, bu da RC-LH116 RC-nin N-terminal bölgəsi ilə demək olar ki, eynidir. Həmçinin qeyd etmək lazımdır ki, yuyucu əsaslı LH1 antenasının aradan qaldırılmasından sonra PDB-dəki apolipoprotein RC-lər həll edildi və bu da RC ilə ətrafdakı LH1 halqasının daxili səthi arasındakı boşluqdakı daxili xinon hovuzlarını və lipidləri aradan qaldırdı (31, 32). RC, daha az sabit olan və hazırlama prosesi zamanı tez-tez itirilən parçalana bilən QB xinon istisna olmaqla, bütün kofaktorları saxladığı üçün funksional olaraq qalır (33). Bundan əlavə, RC-dən LH1 və təbii tsiklik lipidlərin çıxarılması funksiyalara, məsələn, yüklə ayrılmış P+QB-halının qısaldılmış ömrü kimi təsir göstərə biləcəyi məlumdur (31, 34, 35). Buna görə də, RC-ni əhatə edən yerli LH1 halqasının mövcudluğunun "qapalı" QB sahəsini saxlaya biləcəyini və bununla da QB yaxınlığındakı yerli mühiti qoruyub saxlaya biləcəyini fərz edirik.
Apolipoprotein (QB xinon olmadan) və tam struktur QB sahəsinin dövriyyəsinin yalnız iki anlıq görüntüsünü təmsil etsə də, bir sıra hadisələrdən daha çox, bağlanmanın hidrokinon tərəfindən yenidən bağlanmasının qarşısını almaq üçün bağlana biləcəyinə dair əlamətlər mövcuddur. Substrat inhibisiyasını inhibə etmək üçün. Apolipoproteinin QB sahəsi yaxınlığında xinolol və xinonun qarşılıqlı təsiri fərqli ola bilər ki, bu da onun RC tərəfindən rədd edilməsinə səbəb olur. Konformasiya dəyişikliklərinin xinonların bağlanmasında və reduksiyasında rol oynadığı uzun müddətdir irəli sürülür. Dondurulmuş RC-lərin qaranlıq adaptasiyadan sonra xinonları reduksiya etmək qabiliyyəti pozulur (36); Rentgen kristalloqrafiyası göstərir ki, bu zədələnmə QB xinonlarının aktiv proksimal mövqedən təxminən 4,5 Å məsafədə "distal" konformasiyada qalması ilə əlaqədardır (26), 37). Biz bu distal bağlanma konformasiyasının apolipoprotein və tam halqa strukturu arasındakı aralıq vəziyyətin anlıq görüntüsü olduğunu düşünürük ki, bu da xinonla ilkin qarşılıqlı təsirdən və QB sahəsinin açılmasından sonra baş verir.
Müəyyən fototrof bakteriyaların və siyanobakteriyaların, yosunların və bitkilərin PSII kompleksində tapılan II tip RC struktur və funksional qorunmaya malikdir (38). Şəkil 6-da (D və E) göstərilən struktur uyğunlaşma PSII RC-ləri ilə bakterial RC kompleksinin QB sahəsi arasındakı oxşarlığı vurğulayır. Bu müqayisə uzun müddətdir ki, xinon bağlanması və reduksiyasının yaxından əlaqəli sistemlərini öyrənmək üçün bir model olmuşdur. Əvvəlki nəşrlərdə konformasiya dəyişikliklərinin xinonların PSII reduksiyası ilə müşayiət olunduğu irəli sürülmüşdür (39, 40). Buna görə də, RC-nin təkamül qorunmasını nəzərə alsaq, əvvəllər müşahidə olunmayan bu bağlanma mexanizmi oksigenli fototrof bitkilərdə PSII RC-nin QB sahəsinə də tətbiq oluna bilər.
Rps ΔpufW (etiketsiz pufW silinməsi) və PufW-His (təbii pufW lokusundan ifadə edilən C-terminal 10x His-etiketli protein-W) ştammları. palustris CGA009 əvvəlki işimizdə (16) təsvir edilmişdir. Bu ştammlar və izogen vəhşi tipli valideyn, az sayda hüceyrəni PYE (hər biri 5 q litr -1) (LB-də -80 °C-də saxlanılan, 50% (w/v) qliserol) proteini, maya ekstraktı və suksinat) aqar [1.5% (w/v)] ehtiva edən lövhədə zolaqlamaqla dondurucudan çıxarılmışdır. Lövhə, otaq temperaturunda qaranlıqda anaerob şəraitdə bir gecə inkubasiya edilmiş və sonra tək bir koloniya görünənə qədər 3-5 gün ərzində OSRAM 116-W halogen lampaları (RS Components, Böyük Britaniya) tərəfindən təmin edilən ağ işıq (~50 μmolm-2 s-1) ilə işıqlandırılmışdır. Tək bir koloniya 0,1% (ç/v) kazamin turşuları (bundan sonra M22) ilə zənginləşdirilmiş 10 ml M22+ mühitini (41) peyvənd etmək üçün istifadə edilmişdir. Kultura qaranlıqda, 34°C-də, 180 dövr/dəqiqədə çalxalanaraq 48 saat ərzində aşağı oksigen şəraitində yetişdirilmiş və sonra 70 ml kultura eyni şəraitdə 24 saat ərzində peyvənd edilmişdir. 30 ml universal vintli şəffaf şüşə butulkada 30 ml M22 mühitini peyvənd etmək üçün 1 ml həcmli yarı aerob kulturadan istifadə edilmiş və steril maqnit qüvvəsi ilə qarışdırıcı çubuqla 48 saat ərzində qarışdırma (~50μmolm-2 s-1) ilə şüalandırılmışdır. Daha sonra 30 ml kultura eyni şəraitdə təxminən 1 litr kultura ilə peyvənd edilmiş, daha sonra isə təxminən 9 litr kultura 72 saat ərzində ~200 μmolm-2 s-1-də işıqlandırılmış kultura peyvənd etmək üçün istifadə edilmişdir. Hüceyrələr 7132 RCF-də 30 dəqiqə ərzində santrifüqləmə yolu ilə toplandı, təxminən 10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) məhlulunda yenidən əridildi və lazım olana qədər -20°C-də saxlanıldı.
Əridildikdən sonra, yenidən suspenziya edilmiş hüceyrələrə deoksiribonukleaza I (Merck, Böyük Britaniya) kristalları, lizozim (Merck, Böyük Britaniya) və iki Roche holoenzim proteaz inhibitor tableti (Merck, Böyük Britaniya) əlavə edin. 20.000 psi Fransız təzyiqli hüceyrəsində (Aminco, ABŞ) hüceyrələr 8-12 dəfə parçalanmışdır. Sınıq olmayan hüceyrələr və həll olmayan qalıqlar 18.500 RCF-də 4°C-də 15 dəqiqə santrifüqləmə yolu ilə çıxarıldıqdan sonra, membran piqmentli lizatdan 43.000°C-də 2 saat ərzində 113.000 RCF-də santrifüqləmə yolu ilə çökdürülmüşdür. Həll olan fraksiyanı atın və rəngli membranı 100-200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) içində yenidən suspenziya edin və görünən aqreqatlar qalmayana qədər homogenləşdirin. Asılmış membran, 2% (w/v) β-DDM tərkibli 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, ABŞ) məhlulunda 4°C-də qaranlıqda 1 saat ərzində yumşaq qarışdıraraq inkubasiya edildi. Daha sonra qalıq həll olunmayan maddələri çıxarmaq üçün 150.000 RCF-ni 4°C-də 1 saat ərzində həll etmək üçün 70°C-də santrifüj edildi.
ΔpufW ştammından həlledici membran, üç sütun həcmi (CV) bağlayıcı bufer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) 0.03% (w / v) β-DDM] olan 50 ml DEAE Sepharose ion mübadiləsi sütununa tətbiq edildi. Sütunu iki CV bağlayıcı buferi ilə yuyun, sonra sütunu 50 mM NaCl olan iki bağlayıcı bufer ilə yuyun. RC-LH116 kompleksi 1.75 CV-də 150 ​​ilə 300 mM NaCl xətti qradiyenti ilə (bağlayıcı buferdə), qalan bağlayıcı kompleks isə 0.5 CV-də 300 mM NaCl olan bağlayıcı bufer ilə elütləşdirildi. 250 ilə 1000 nm arasında udma spektrini toplayın, udma nisbəti (A880/A280) 1-dən çox olan fraksiyanı 880 ilə 280 nm arasında saxlayın, bağlayıcı buferdə iki dəfə durulaşdırın və eyni proseduru DEAE sütununda Təmizləmə zamanı təkrar istifadə edin. A880/A280 nisbətləri 1,7-dən və A880/A805 nisbətləri 3,0-dan yüksək olan fraksiyaları durulaşdırın, ion mübadiləsinin üçüncü turunu həyata keçirin və A880/A280 nisbətləri 2,2-dən və A880/A805 nisbətləri 5,0-dən yüksək olan fraksiyaları saxlayın. Qismən təmizlənmiş kompleks Amicon 100.000 molekulyar çəki kəsmə (MWCO) mərkəzdənqaçma filtrində (Merck, Böyük Britaniya) ~2 ml-ə qədər konsentratlaşdırılmış və 200 mM NaCl buferi olan Superdex 200 16/600 ölçülü xaricetmə sütununa (GE Healthcare, ABŞ) yüklənmiş və sonra eyni buferdə 1,5 CV-də elusiya edilmişdir. Ölçü xaricetmə fraksiyasının udma spektrlərini toplayın və udma spektrlərini 2,4 üzərində A880/A280 və 5,8-dən 100 A880-ə qədər A880/A805 nisbətləri üzərində konsentratlaşdırın və dərhal krio-TEM şəbəkəsinin hazırlanması və ya saxlanması üçün istifadə edin. Lazım olana qədər -80°C-də saxlayın.
PufW-His ştammından alınan həlledici membran, IMAC buferində (GE Healthcare) 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose sütununa (200 mM NaCl və 0,03% (ç/ç)) 20 mM tris-HCl (pH 8.0)) tətbiq edildi. v) β-DDM]. Sütun beş CV IMAC buferi ilə, sonra isə 10 mM histidin ehtiva edən beş CV IMAC buferi ilə yuyuldu. Əsas kompleks sütundan 100 mM histidin ehtiva edən beş IMAC buferi ilə elusiya edildi. RC-LH114-W kompleksini ehtiva edən fraksiya, Amicon 100,000 MWCO filtri (Merck, Böyük Britaniya) ilə təchiz olunmuş qarışdırılmış bir çəndə ~10 ml-ə qədər konsentrə edilir, bağlayıcı buferlə 20 dəfə seyreltilir və sonra 25 ml-ə əlavə edilir. DEAE Sepharose sütununda əvvəlcədən buferə bağlı dörd CV istifadə olunur. Sütunu dörd CV bağlayıcı buferi ilə yuyun, sonra kompleksi 0-dan 100 mM NaCl-a qədər xətti qradiyentdə (bağlayıcı buferdə) səkkiz CV-də elute edin və qalan dörd CV-də 100 mM bağlayıcı bufer var. Natrium xlorid üzərində elute edilmiş qalıq komplekslər, 2,4-dən yüksək A880/A280 nisbəti və 4,6-dan yüksək A880/A805 nisbəti fraksiyaları ilə birləşdirilərək Amicon 100,000 MWCO mərkəzdənqaçma filtrində ~2 ml-ə qədər konsentrasiya edildi və əvvəlcədən 1,5 CV IMAC ilə dolduruldu. Bufer Superdex 200 16/600 ölçülü xaricetmə sütununu tarazlaşdırdı və sonra eyni buferdə 1,5 CV üzərində elute edildi. Ölçü-çıxarılma fraksiyalarının udma spektrlərini toplayın və udma spektrlərini 2.1-dən yuxarı A880/A280 nisbətləri və 4.6-dan yuxarı A880/A805 nisbətləri ilə 100 A880-ə qədər cəmləşdirin, bunlar dərhal dondurulmuş TEM şəbəkəsinin hazırlanması üçün istifadə olunur və ya ehtiyac olana qədər -80°C-də saxlanılır.
Aşağı temperaturlu TEM torlarını hazırlamaq üçün Leica EM GP immersion dondurucusu istifadə edilmişdir. Kompleks IMAC buferində A880 of 50-yə qədər durulaşdırılmış və sonra 5μl yeni parıltılı boşaldılmış QUANTIFOIL 1.2/1.3 karbon örtüklü mis toruna (Agar Scientific, Böyük Britaniya) yüklənmişdir. Toru 20°C və 60% nisbi rütubətdə 30 saniyə inkubasiya edin, sonra 3 saniyə qurudun və sonra -176°C-də maye etanda söndürün.
RC-LH114-W kompleksinin məlumatları, 300 kV sürətləndirici gərginlikdə işləyən, nominal böyütmə 130.000× və 20 eV enerji ilə işləyən Titan Krios mikroskopu ilə eBIC-də (Elektron Biogörüntüləmə Mərkəzi) (Britaniya Almaz İşıq Mənbəyi) qeyd edildi. Məlumat toplamaq üçün sayma rejimində şəkilləri qeyd etmək üçün K2 pik detektorlu Gatan 968 GIF Quantum istifadə edildi. Kalibrlənmiş piksel ölçüsü 1.048Å, doza sürəti isə 3.83 e-Å-2s-1-dir. Film 11 saniyədə toplandı və 40 hissəyə bölündü. Mikroskopu yenidən fokuslamaq üçün karbon örtüklü sahədən istifadə edin və sonra hər dəlikdən üç film toplayın. Ümumilikdə, -1 ilə -3μm arasında defokus dəyərləri ilə 3130 film toplandı.
RC-LH116 kompleksi üçün məlumatlar Asterbury Biostruktur Laboratoriyasında (Lids Universiteti, Böyük Britaniya) eyni mikroskopdan istifadə edilərək toplanmışdır. Məlumatlar 130 k böyütmə ilə sayma rejimində toplanmış və piksel ölçüsü 4.6 e-Å-2s-1 dozası ilə 1.065 Å-yə kalibrlənmişdir. Film 12 saniyədə qeydə alınmış və 48 hissəyə bölünmüşdür. Ümumilikdə, -1 ilə -3μm arasında defokus dəyərləri olan 3359 film toplanmışdır.
Bütün məlumatların emalı Relion 3.0 boru kəmərində (42) həyata keçirilir. Doza ağırlığı ilə şüa hərəkətini düzəltmək üçün Motioncorr 2 (43) istifadə edin və sonra CTF (kontrast ötürmə funksiyası) parametrini təyin etmək üçün CTFFIND 4.1 (44) istifadə edin. Bu ilkin emal mərhələlərindən sonra tipik fotomikroqrafiyalar Şəkil 2-də göstərilmişdir. S16. Avtomatik seçim şablonu, 250 piksellik çərçivədə və istinad ikiölçülü (2D) təsnifatı olmayan 1000 hissəciyin təxminən 250 pikselini əl ilə seçməklə yaradılır və bununla da nümunə çirklənməsinə cavab verən və ya heç bir fərqləndirilə bilən xüsusiyyətlərə malik olmayan təsnifatlar rədd edilir. Daha sonra bütün mikrofotoşəkillərdə avtomatik seçim aparıldı və RC-LH114-W 849.359 hissəcik, RC-LH116 kompleksi isə 476.547 hissəcik idi. Bütün seçilmiş hissəciklər iki mərhələdə istinad olunmayan 2D təsnifatından keçib və hər sınaqdan sonra karbon sahəsinə uyğun gələn, nümunə çirklənməsinə səbəb olan, aşkar xüsusiyyətləri olmayan və ya güclü şəkildə üst-üstə düşən hissəciklər rədd edilir və nəticədə müvafiq olaraq 772.033 (90.9%) və 359.678 (75.5%) hissəciklər RC-LH114-W və RC-LH116-nın 3D təsnifatı üçün istifadə olunur. İlkin 3D istinad modeli stoxastik qradiyent enmə metodundan istifadə etməklə yaradılıb. İlkin modeli istinad kimi istifadə edərək, seçilmiş hissəciklər 3D-də dörd kateqoriyaya təsnif edilir. Bu kateqoriyadakı modeli istinad kimi istifadə edərək, ən böyük kateqoriyadakı hissəciklər üzərində 3D təmizlənməsi aparın, sonra həlledici sahəsini örtmək üçün ilkin 15Å aşağı keçidli filtrdən istifadə edin, yumşaq kənarlardan 6 piksel əlavə edin və üst detektorun Gatan K2 pik Modulyasiya ötürmə funksiyasını düzəltmək üçün pikselləri sonradan emal edin. RC-LH114-W məlumat dəsti üçün bu ilkin model maskanın kənarlarındakı güclü sıxlığı (UCSF Chimera-dakı əsas kompleks sıxlığından ayrılmış) çıxarmaqla dəyişdirilmişdir. Nəticədə yaranan modellər (RC-LH114-W və RC-LH116-nın qətnamələri müvafiq olaraq 3.91 və 4.16 Å-dir) 3D təsnifatının ikinci mərhələsi üçün istinad kimi istifadə olunur. İstifadə olunan hissəciklər ilkin 3D sinfinə qruplaşdırılıb və qonşuluqla güclü korrelyasiya ehtiva etmir. Üst-üstə düşür və ya aşkar struktur xüsusiyyətlərinin olmaması. 3D təsnifatının ikinci mərhələsindən sonra ən yüksək qətnaməyə malik kateqoriya seçildi [RC-LH114-W üçün bir kateqoriya 377.703 hissəcikdir (44.5%), RC-LH116 üçün isə cəmi 260.752 hissəcikdir (54.7%), burada onlar yalnız kiçik bir fərqlə ilkin fırlanmadan sonra hizalandıqda eynidirlər]. Seçilmiş hissəciklər 400 piksellik qutuda yenidən çıxarılır və 3D təmizləmə yolu ilə təmizlənir. Həlledici maska ​​ilkin 15Å aşağı keçidli filtr, 3 piksel xəritə genişləndirilməsi və 3 piksel yumşaq maska ​​istifadə edilərək yaradılır. Hər mərhələdən sonra hissəcik başına CTF təmizləmə, hissəcik başına hərəkət korreksiyası və hissəcik başına CTF təmizləməsinin ikinci mərhələsi istifadə edilərək, nəticədə əldə edilən teksturanı daha da təmizləmək üçün 3D təmizləmə, həlledici maskası və sonrakı emal aparılır. 0.143 FSC (Furye Qabıq Korrelyasiya Əmsalı) kəsmə dəyəri istifadə edilərək, RC-LH114-W və RC-LH116-nın son modellərinin qətnamələri müvafiq olaraq 2.65 və 2.80Å-dir. Son modelin FSC əyrisi Şəkil 2-də göstərilmişdir. S17.
Bütün protein ardıcıllıqları UniProtKB-dən yüklənir: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC-L, RC-M və RC-H protein ardıcıllıqlarını və Rba-nın kristal quruluşunu ehtiva edən RC-nin homoloji modelini qurmaq üçün SWISS-MODEL (45) istifadə edilmişdir. Şablon olaraq RC istifadə edilmişdir (PDB ID: 5LSE) (46). Yaradılmış modeli xəritəyə (47) uyğunlaşdırmaq, zülal strukturunu təkmilləşdirmək və kofaktor [4×BChlα (monomer kitabxanası qalıq adı = BCL), 2×BPhα (BPH), bir və ya iki növ UQ10 (U10), bir qeyri-hem dəmiri (Fe) və bir 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] əlavə etmək üçün Coot (48) istifadə edin. QAK monomer kitabxanasında mövcud olmadığı üçün PHENIX (49)-dakı eLBOW alətindən istifadə edərək parametrləşdirilib.
Daha sonra LH1 alt vahidi quruldu. Əvvəlcə, PHENIX-dəki (49) avtomatik tikinti aləti xəritədən və giriş kimi LH1-α və LH1-β zülal ardıcıllıqlarından istifadə edərək LH1 ardıcıllığının bir hissəsini avtomatik olaraq qurmaq üçün istifadə edildi. Ən tam LH1 alt vahidini seçin, çıxarın və Coot-a yükləyin, itkin ardıcıllığı əl ilə əlavə edin və iki BCl a (BCL) və spirilloksantin (CRT) əlavə etməzdən əvvəl bütün quruluşu əl ilə dəqiqləşdirin [müvafiq Rps-ə uyğun olaraq LH1 kompleksinin sıxlığı və məlum karotenoid tərkibi. Növlər (17)]. Tam LH1 alt vahidini kopyalayın və UCSF Chimera “Docking Map Tool”-dan istifadə edərək LH1 sıxlığının bitişik model olmayan sahəsinə yerləşdirin və sonra Coot-da dəqiqləşdirin; bütün LH1 alt vahidləri modelləşdirilənə qədər prosesi təkrarlayın. RC-LH114-W strukturu üçün, Coot-dakı bölüşdürülməmiş sıxlığı çıxarmaqla, zülal USCF Ximera xəritəsindəki qalan qeyri-zülal komponentlərindən seqmentləşdirilir və Autobuild aləti ilkin modeli və qalan alt vahidləri (protein-W) Modelləşdirməni qurmaq üçün istifadə olunur. PHENIX-də (49). Coot-da (48) yaranan modelə itkin ardıcıllıqları əlavə edin və sonra bütün alt vahidi əl ilə dəqiqləşdirin. Qalan bölüşdürülməmiş sıxlıq lipidlərin (CDL = CDL, POPC = 6PL və POPG = PGT PDB monomer kitabxana ID), β-DDM yuyucu vasitəsinin (LMT) və UQ10 molekullarının (U10) kombinasiyasına uyğun gəlir. Model statistikası və uyğunluğun vizual keyfiyyəti daha da yaxşılaşdırıla bilənə qədər tam ilkin modeli təkmilləşdirmək üçün Coot-da PHENIX optimallaşdırmasından (49) və əl ilə optimallaşdırmadan (48) istifadə edin. Nəhayət, yerli xəritəni dəqiqləşdirmək üçün LocScale (50) istifadə edin və sonra bölüşdürülməmiş sıxlığın modelləşdirilməsinin bir neçə digər dövrünü, avtomatik və əl ilə optimallaşdırmanı yerinə yetirin.
Müvafiq sıxlıqları daxilində yerləşdirilmiş müvafiq peptidlər, kofaktorlar və digər lipidlər və xinonlar Şəkil 1 və 2-də göstərilmişdir. S18-dən S23-ə qədər. Son modelin statistik məlumatları Cədvəl S1-də göstərilmişdir.
Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, UV/Vis/NIR udma spektrləri Cary60 spektrofotometrində (Agilent, ABŞ) 250 nm-dən 1000 nm-ə qədər 1 nm intervallarla və 0,1 saniyə inteqrasiya müddəti ilə toplanmışdır.
Nümunəni 2 mm uzunluğunda A880-ə qədər 1 olan kvars küvetində durulaşdırın və 400 ilə 1000 nm arasında udma spektrini toplayın. Dairəvi dixroik spektrlər Jasco 810 spektropolyarimetrində (Jasco, Yaponiya) 400 nm ilə 950 nm arasında 1 nm intervallarla 20 nm dəq-1 skanlama sürəti ilə toplanmışdır.
Molar sönmə əmsalı, əsas kompleksin təxminən 50 A880-ə qədər durulaşdırılması ilə müəyyən edilir. 10μl həcmi 990μl bağlayıcı buferdə və ya metanolda durulaşdırın və BChl parçalanmasını minimuma endirmək üçün dərhal udma spektrini toplayın. Hər bir metanol nümunəsinin BChl tərkibi 54.8 mM-1 sm-1-in 771 nm-də sönmə əmsalı ilə hesablandı və sönmə əmsalı təyin edildi (51). Ölçülmüş BChl konsentrasiyasını 32-yə (RC-LH114-W) və ya 36-ya (RC-LH116) bölməklə əsas kompleks konsentrasiyasını təyin edin, bu da sonra buferdə toplanan eyni nümunənin udma spektrini təyin etmək üçün istifadə olunur. Sönmə əmsalı. Hər nümunə üçün üç təkrar ölçmə aparıldı və hesablama üçün BChl Qy maksimumunun orta udma qabiliyyətindən istifadə edildi. 878 nm-də ölçülən RC-LH114-W-nin sönmə əmsalı 3280±140 mM-1 sm-1, 880 nm-də ölçülən RC-LH116-nın sönmə əmsalı isə 3800±30 mM-1 sm-1-dir.
UQ10 (52)-dəki metoda uyğun olaraq kəmiyyətləndirildi. Bir sözlə, tərs fazalı HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC sistemi istifadə edilərək həyata keçirildi. Təxminən 0,02 nmol RC-LH116 və ya RC-LH114-W 0,02% (w/v) dəmir xlorid tərkibli 50μl 50:50 metanol:xloroformda həll edin və əvvəlcədən tarazlaşdırılmış Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm-ni × 25 sm sütunda 40°C-də 1 ml-1 dəq-1-də HPLC həlledicisində (80:20 metanol:2-propanol) həll edin. 275 nm (UQ10), 450 nm (karotinoidlər) və 780 nm (BChl)-də 1 saat ərzində udma qabiliyyətini izləmək üçün HPLC həlledicisində izokratik elusiya aparın. 275 nm xromatoqramdakı pik 25,5 dəqiqədə inteqrasiya edildi və tərkibində başqa aşkar edilə bilən birləşmələr yox idi. İnteqral sahə, 0-dan 5,8 nmol-a qədər təmiz standartların yeridilməsindən hesablanmış kalibrləmə əyrisinə istinadən çıxarılan UQ10-un molar miqdarını hesablamaq üçün istifadə olunur (Şəkil S14). Hər bir nümunə üç təkrarlamada təhlil edildi və bildirilən xəta ortalamanın SD-sinə uyğundur.
Maksimum Qy absorbsiyası 0,1 olan RC-LH1 kompleksini ehtiva edən bir məhlul 30 μM reduksiya edilmiş at ürəyi sitoxromu c2 (Merck, Böyük Britaniya) və 0-dan 50 μMUQ2-yə (Merck, Böyük Britaniya) istifadə edilərək hazırlanmışdır. Hər UQ2 konsentrasiyasında üç 1 ml nümunə hazırlanmış və ölçmədən əvvəl qaranlığa tam uyğunlaşma təmin etmək üçün gecə qaranlıqda 4°C-də inkubasiya edilmişdir. Məhlul 300 nm alov/500 xəttli barmaqlıq, 1,24 mm giriş, 0,12 mm orta və 0,6 mm çıxış yarıqları ilə təchiz olunmuş OLIS RSM1000 modul spektrofotometrinə yüklənmişdir. Həyəcan işığını istisna etmək üçün nümunə fototubunun və istinad fotovurucu borusunun girişinə 600 nm uzunluğunda keçid filtri yerləşdirilmişdir. Absorbsiya 0,15 saniyə inteqrasiya müddəti ilə 550 nm-də izlənilmişdir. Həyəcan işığı 880 nm M880F2 LED-dən (İşıq Yayan Diod) (Thorlabs Ltd., Böyük Britaniya) 90% intensivlikdə DC2200 nəzarətçisi (Thorlabs Ltd., Böyük Britaniya) vasitəsilə fiber optik kabel vasitəsilə yayılır və 90° bucaq altında işıq mənbəyinə yayılır. Ölçmə şüası nümunə tərəfindən əvvəlcə udulmayan hər hansı bir işığı qaytarmaq üçün güzgüyə qarşı qoyulur. 50 saniyəlik işıqlandırmadan əvvəl udma qabiliyyətini 10 saniyə izləyin. Daha sonra xinololun sitoxrom c23+-i özbaşına nə dərəcədə azaltdığını qiymətləndirmək üçün qaranlıqda 60 saniyə ərzində udma qabiliyyəti daha da izlənildi (xam məlumatlar üçün Şəkil S8-ə baxın).
Məlumatlar 0,5 ilə 10 saniyə arasında xətti başlanğıc sürəti (UQ2 konsentrasiyasından asılı olaraq) uyğunlaşdırmaqla və hər üç nümunənin sürətlərini hər UQ2 konsentrasiyasında orta hesablamaqla işlənmişdir. Müvafiq sönmə əmsalı ilə hesablanmış RC-LH1 konsentrasiyası sürəti katalitik səmərəliliyə çevirmək üçün istifadə edilmişdir, Origin Pro 2019-da (OriginLab, ABŞ) təsvir edilmişdir və görünən Km və Kcat dəyərlərini təyin etmək üçün Michaelis-Menten modelinə uyğunlaşdırılmışdır.
Keçici absorbsiya ölçmələri üçün RC-LH1 nümunəsi 50 mM natrium askorbat (Merck, ABŞ) və 0,4 mM Terbutin (Merck, ABŞ) ehtiva edən IMAC buferində ~2μM-ə qədər durulaşdırıldı. Askorbin turşusu qurbanlıq elektron donoru kimi, tert-butaklofen isə əsas RC donorunun ölçmə prosesi boyunca reduksiya olunmuş (yəni fotooksidləşməmiş) qalmasını təmin etmək üçün QB inhibitoru kimi istifadə olunur. Lazer yolundakı nümunənin həyəcan impulsları arasında qaranlıq adaptasiyası üçün kifayət qədər vaxta malik olmasını təmin etmək üçün 2 mm optik yol uzunluğuna malik xüsusi fırlanan hüceyrəyə (təxminən 0,1 m diametrdə, 350 RPM) təxminən 3 ml nümunə əlavə edilir. Nümunəni 880 nm-də 1 kHz təkrarlanma sürətində (NIR üçün 20 nJ və ya Vis üçün 100 nJ) həyəcanlandırmaq üçün Ti: Sapphire lazer sistemini (Spectra Physics, ABŞ) gücləndirmək üçün ~100-fs lazer impulslarından istifadə edin. Məlumat toplamazdan əvvəl nümunəni təxminən 30 dəqiqə həyəcan işığına məruz qoyun. Təsir QA-nın inaktivləşməsinə səbəb olacaq (ehtimal ki, QA-nı bir və ya iki dəfə azaldacaq). Lakin unutmayın ki, bu proses geri çevrilə bilər, çünki uzun müddət qaranlıq adaptasiyadan sonra RC yavaş-yavaş QA aktivliyinə qayıdacaq. -10 ilə 7000 ps gecikmə müddəti olan keçici spektrləri ölçmək üçün Helios spektrometrindən (Ultrafast Systems, ABŞ) istifadə edilmişdir. Məlumat dəstlərini qruplaşdırmaq, sonra birləşdirmək və standartlaşdırmaq üçün Surface Xplorer proqram təminatından (Ultrafast Systems, ABŞ) istifadə edin. Çürümə ilə əlaqəli diferensial spektrləri əldə etmək üçün birləşdirilmiş məlumat dəstindən istifadə etmək üçün CarpetView proqram paketindən (Light Conversion Ltd., Litva) istifadə edin və ya Origin-də (OriginLab, ABŞ) tək dalğa uzunluğundakı spektral təkamülə uyğunlaşmaq üçün birdən çox eksponenti cihazın cavabı ilə birləşdirən funksiyadan istifadə edin.
Yuxarıda qeyd edildiyi kimi (53), həm RC, həm də periferik LH2 antenasından məhrum olan LH1 kompleksini ehtiva edən fotosintetik film hazırlanmışdır. Membran 20 mM trisdə (pH 8.0) durulaşdırılmış və sonra 2 mm optik yolu olan kvars küvetinə yüklənmişdir. Nümunəni 540 nm-də -10 ilə 7000 ps gecikmə müddəti ilə həyəcanlandırmaq üçün 30nJ lazer impulsu istifadə edilmişdir. Məlumat dəstini Rps. pal nümunəsi üçün təsvir olunduğu kimi emal edin.
Membran 150.000 RCF-də 4°C-də 2 saat ərzində santrifüqləmə yolu ilə dənəvərləşdirildi və sonra 880 nm-də absorbsiyası 20 mM tris-HCl (pH 8.0) və 200 mM NaCl-də yenidən suspenziya edildi. Membranı qaranlıqda 4°C-də 1 saat ərzində 2% (w/v) β-DDM-də yavaş-yavaş qarışdıraraq həll edin. Nümunə 100 mM trietilamonium karbonatda (pH 8.0) (TEAB; Merck, Böyük Britaniya) 2.5 mq ml-1 zülal konsentrasiyasına qədər durulaşdırıldı (Bio-Rad analizi). Daha əvvəl dərc edilmiş metoddan (54) əlavə emal aparıldı, 50 μg zülalın 1% (w/v) natrium laurat ehtiva edən cəmi 50 μl TEAB-a durulaşdırılması ilə başladı (Merck, Böyük Britaniya). 60 saniyə ərzində ultrasəslə işləmədən sonra, 37°C-də 30 dəqiqə ərzində 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, Böyük Britaniya) ilə reduksiya edildi. S-alkilləşdirmə üçün nümunəni 10 mM metil S-metiltiometansulfonat (Merck, Böyük Britaniya) ilə inkubasiya edin və 200 mM izopropanol məhlulundan otaq temperaturunda 10 dəqiqə əlavə edin. Proteolitik həzm 2 μg tripsin/endoproteinaza Lys-C qarışığı (Promega UK) əlavə edilməklə və 37°C-də 3 saat inkubasiya edilməklə aparıldı. Laurat səthi aktiv maddəsi 50 μl etil asetat və 10 μl 10% (v/v) LC dərəcəli trifluorosetik turşu (TFA; Thermo Fisher Scientific, Böyük Britaniya) əlavə edilərək və 60 saniyə ərzində vorteksləşdirilərək çıxarıldı. Faza ayrılması 15.700 RCF-də 5 dəqiqə ərzində santrifüqləmə yolu ilə təşviq edildi. İstehsalçının protokoluna əsasən, peptidi ehtiva edən aşağı fazanı diqqətlə aspirasiya etmək və duzsuzlaşdırmaq üçün C18 spin sütunundan (Thermo Fisher Scientific, Böyük Britaniya) istifadə edildi. Vakuum santrifüqləmə ilə quruduqdan sonra nümunə 0,5% TFA və 3% asetonitrildə həll edildi və 500 ng əvvəllər ətraflı təsvir edilmiş sistem parametrlərindən istifadə edərək kütlə spektrometriyası ilə birləşdirilmiş nanoflow RP xromatoqrafiyası ilə təhlil edildi.
Rps. palustris proteome verilənlər bazasını (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) axtarmaq üçün zülalın identifikasiyası və kəmiyyətləndirilməsi üçün MaxQuant v.1.5.3.30 (56) istifadə edin. Kütlə spektrometriyası proteomikası məlumatları PXD020402 verilənlər bazası identifikatoru altında PRIDE tərəfdaş deposu (http://proteomecentral.proteomexchange.org) vasitəsilə ProteomeXchange Alyansına yerləşdirilib.
Elektrosprey ionlaşma kütlə spektrometriyası ilə birləşdirilmiş RPLC ilə analiz üçün RC-LH1 kompleksi vəhşi tipli Rps-lərdən hazırlanmışdır. Əvvəllər dərc edilmiş metoddan (16) istifadə edərək, palustris hüceyrələrində istehsal olunan zülal konsentrasiyası 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl və 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analizi)) DDM-də 2 mq ml-1 təşkil etmişdir. İstehsalçının protokoluna əsasən, çökmə üsulu ilə 10 mkq zülal çıxarmaq üçün 2D təmizləmə dəstindən (GE Healthcare, ABŞ) istifadə edin və çöküntünü 20 mkl 60% (v/v) qarışqa turşusu (FA), 20% (v/v) Asetonitril və 20% (v/v) suda həll edin. Beş mikrolitr RPLC (Dionex RSLC) ilə birlikdə kütlə spektrometriyası (Maxis UHR-TOF, Bruker) ilə analiz edilmişdir. 60°C və 100μlmin -1 temperaturda ayrılması üçün MabPac 1.2×100 mm sütunundan (Thermo Fisher Scientific, Böyük Britaniya) istifadə edin, 85% (v / v) həlledici A [0.1% (v / v) FA və 0.02% (V/v) TFA sulu məhlulu] ilə 85%(v/v) həlledici B [90%(v/v) asetonitril TFA-da 0.1%(v/v) FA və 0.02%(v/v)] arasında qradiyent seçin. Standart elektrosprey ionlaşma mənbəyi və standart parametrlərdən 60 dəqiqədən çox istifadə edərək, kütlə spektrometri 100 ilə 2750 m/z (kütlə-yük nisbəti) əldə edir. ExPASy bioinformatika resurs portalı FindPept alətinin (https://web.expasy.org/findpept/) köməyi ilə kütlə spektrini kompleksin alt vahidlərinə xəritələşdirin.
Hüceyrələr 100 ml NF-aşağı (10μMm-2 s-1), orta (30μMm-2 s-1) və ya yüksək (300μMm-2 s-1) işıq altında 72 saat yetişdirildi. M22 mühiti (ammonium sulfatın əlavə edilmədiyi və natrium suksinatın natrium asetatla əvəz olunduğu M22 mühiti) 100 ml-lik vintli şüşədə (23). Beş 30 saniyəlik dövrdə hüceyrələri lizis etmək üçün 0,1 mikronlu şüşə muncuqlar 1:1 həcm nisbətində muncuqlandı və 5 dəqiqə buz üzərində soyuduldu. Həll olmayan maddə, qırılmamış hüceyrələr və şüşə muncuqlar masaüstü mikrosantrifüjdə 16000 RCF-də 10 dəqiqə santrifüqləmə yolu ilə çıxarıldı. Membran, 10 saat ərzində 40/15% (ç/ç) saxaroza qradiyenti ilə 20 mM tris-HCl (pH 8.0) içində 100.000 RCF ilə Ti 70.1 rotorunda ayrıldı.
Əvvəlki işimizdə təsvir edildiyi kimi, PufW (16) üzərində His etiketinin immunodeteksiyası. Bir sözlə, 2x SDS yükləmə buferində (Merck, Böyük Britaniya) təmizlənmiş əsas kompleks (11.8 nM) və ya eyni konsentrasiyalı RC ehtiva edən membran (oksidləşmə yolu ilə müəyyən edilir, azaldılmış fərq spektrini çıxmaq və boyanmış geldəki yükü uyğunlaşdırmaqla) iki dəfə seyreltildi. Zülallar replika 12% bis-tris NuPage gelində (Thermo Fisher Scientific, Böyük Britaniya) ayrıldı. RC-L alt vahidini yükləmək və vizuallaşdırmaq üçün bir gel Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Böyük Britaniya) ilə boyandı. İkinci geldəki zülal immunoanaliz üçün metanol ilə aktivləşdirilmiş poliviniliden florid (PVDF) membranına (Thermo Fisher Scientific, Böyük Britaniya) köçürüldü. PVDF membranı 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 və 5% (w / v) yağsız süd tozunda bloklandı və sonra anti-His ilkin antikoru ilə (Dlute the anticisim buferi [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl və 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ABŞ) 4 saat inkubasiya edildi. Antikor buferində 5 dəqiqə ərzində 3 dəfə yuyulduqdan sonra, membran xren peroksidaza (Sigma-Aldrich, Böyük Britaniya) antisiçan ikincili antikoru (antikor buferində 1:10,000 nisbətində durulaşdırılmış) ilə birləşdirildi. WESTAR ETA C 2.0 xemilüminesensiya substratı (Cyanagen, İtaliya) və Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Böyük Britaniya) istifadə edərək aşkarlanmasına imkan vermək üçün (antikor buferində 3 dəfə yuyulduqdan 5 dəqiqə sonra) inkubasiya edildi.
ImageJ (57)-də hər bir boyanmış gel və ya immunoanaliz zolağının intensivlik paylanmasını çəkməklə, pik altındakı sahəni inteqrasiya etməklə və RC-L (boyanmış gel) və Protein-W (immunoanaliz) intensivlik nisbətini hesablamaqla təsviri emal edin. Bu nisbətlər təmiz RC-LH114-W nümunəsində RC-L-in protein-W-yə nisbətinin 1:1 olduğunu fərz etməklə və bütün məlumat dəstini müvafiq olaraq normallaşdırmaqla molar nisbətlərə çevrildi.
Bu məqalə ilə bağlı əlavə materiallar üçün http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 linkinə baxın.
Bu, Creative Commons Attribution Lisenziyasının şərtləri altında paylanan açıq girişli məqalədir. Məqalə, orijinal əsərin düzgün şəkildə istinad edilməsi şərti ilə istənilən mediada məhdudiyyətsiz istifadəyə, yayılmağa və çoxaldılmasına icazə verir.
Qeyd: Səhifəyə tövsiyə etdiyiniz şəxsin e-poçtu görməsini istədiyinizi və spam olmadığını bilməsi üçün yalnız e-poçt ünvanınızı təqdim etməyinizi xahiş edirik. Heç bir e-poçt ünvanını qeyd etməyəcəyik.
Bu sual, ziyarətçi olub-olmadığınızı yoxlamaq və avtomatik spam göndərilməsinin qarşısını almaq üçün istifadə olunur.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaksiya mərkəzindəki işıq tələsi 1 kompleksinin yüksək dəqiqlikli quruluşu, xinon dinamikası haqqında yeni məlumatlar verir.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaksiya mərkəzindəki işıq tələsi 1 kompleksinin yüksək dəqiqlikli quruluşu, xinon dinamikası haqqında yeni məlumatlar verir.
©2021 Amerika Elmin İnkişafı Assosiasiyası. bütün hüquqlar qorunur. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef və COUNTER-ın tərəfdaşıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.