Hazırda *Cari ünvan: Köln 50931, Almaniya, Yaşlanma ilə əlaqəli xəstəliklərdə hüceyrə stressinə qarşı mübarizə üzrə Köln Mükəmməllik Klaster Tədqiqatı (CECAD).
Mitoxondrial xəstəliklərin neyrodegenerasiyası dönməz hesab olunur, çünki neyronların metabolik plastikliyi məhduddur, lakin mitoxondrial disfunksiyanın bədəndə neyron metabolizmasının hüceyrə muxtariyyətinə təsiri zəif başa düşülür. Burada, pozulmuş mitoxondrial birləşmə dinamikasının səbəb olduğu mütərəqqi OXPHOS çatışmazlığı olan Purkinje neyronlarının hüceyrəyə xas proteomunu təqdim edirik. Mitoxondrial disfunksiyanın proteomika sahəsində dərin bir dəyişikliyə səbəb olduğunu və nəticədə hüceyrə ölümündən əvvəl dəqiq metabolik proqramların ardıcıl aktivləşməsinə səbəb olduğunu aşkar etdik. Gözlənilmədən, piruvat karboksilaza (PCx) və TCA dövrünün aralıq məhsullarını tamamlayan digər yaşlanma əleyhinə fermentlərin aşkar induksiyasını müəyyən etdik. PCx-in inhibə edilməsi oksidləşdirici stressi və neyrodegenerasiyanı daha da artırdı ki, bu da aterosklerozun OXPHOS çatışmazlığı olan neyronlarda qoruyucu təsirə malik olduğunu göstərir. Terminal degenerasiya olunmuş neyronlarda mitoxondrial birləşmənin bərpası bu metabolik xüsusiyyətləri tamamilə tərsinə çevirir və bununla da hüceyrə ölümünün qarşısını alır. Tapıntılarımız mitoxondrial disfunksiyaya davamlılıq verən əvvəllər məlum olmayan yolları müəyyən edir və göstərir ki, neyrodegenerasiya hətta xəstəliyin son mərhələlərində belə geri qaytarıla bilər.
Mitoxondrilərin neyron enerji metabolizmasının qorunmasındakı mərkəzi rolu insan mitoxondri xəstəlikləri ilə əlaqəli geniş nevroloji simptomlarla vurğulanır. Bu xəstəliklərin əksəriyyəti mitoxondrial gen ifadəsini tənzimləyən gen mutasiyaları (1, 2) və ya mitoxondrial dinamika ilə əlaqəli genlərin məhv edilməsindən qaynaqlanır ki, bu da dolayı yolla mitoxondrial DNT-nin (mtDNT) sabitliyinə təsir göstərir (3, 4). Heyvan modellərində aparılan işlər göstərib ki, ətraf toxumalarda mitoxondrial disfunksiyaya cavab olaraq, mühafizəkar metabolik yollar (5-7) aktivləşdirilə bilər ki, bu da bu mürəkkəb xəstəliklərin patogenezini dərindən anlamaq üçün vacib məlumat verir. Tam əksinə, beynin mitoxondrial adenozin trifosfat (ATP) istehsalının ümumi çatışmazlığından qaynaqlanan spesifik hüceyrə tiplərinin metabolik dəyişikliklərini anlamağımız fundamentaldır (8), xəstəliklərin qarşısını almaq və ya qarşısını almaq üçün istifadə edilə bilən terapevtik hədəfləri müəyyən etmək ehtiyacını vurğulayır. Neyrodegenerasiyanın qarşısını alın (9). Məlumatın olmaması, sinir hüceyrələrinin ətraf toxumaların hüceyrə tipləri ilə müqayisədə çox məhdud metabolik elastikliyə malik olduğu düşünülməsidir (10). Bu hüceyrələrin sinaptik ötürülməni təşviq etmək və zədələnmə və xəstəlik vəziyyətlərinə cavab vermək üçün neyronlara metabolitlərin tədarükünün əlaqələndirilməsində mərkəzi rol oynadığını nəzərə alsaq, hüceyrə metabolizmasını beyin toxumasının çətin şərtlərinə uyğunlaşdırmaq qabiliyyəti demək olar ki, qlial hüceyrələrlə məhdudlaşır (11-14). Bundan əlavə, beyin toxumasının daxili hüceyrə heterojenliyi müəyyən neyron alt qruplarında baş verən metabolik dəyişikliklərin öyrənilməsinə böyük dərəcədə mane olur. Nəticədə, neyronlarda mitoxondrial disfunksiyanın dəqiq hüceyrə və metabolik nəticələri haqqında az şey məlumdur.
Mitoxondrial disfunksiyanın metabolik nəticələrini anlamaq üçün, mitoxondrial xarici membran birləşməsinin (Mfn2) məhv edilməsi nəticəsində yaranan neyrodegenerasiyanın müxtəlif mərhələlərində Purkinje neyronlarını (PN) təcrid etdik. İnsanlarda Mfn2 mutasiyaları Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15) kimi tanınan irsi motor sensor neyropatiyasının bir forması ilə əlaqəli olsa da, siçanlarda Mfn2-nin şərti məhv edilməsi oksidləşmənin fosforlaşma (OXPHOS) disfunksiya metodunun tanınmış induksiyasıdır. Müxtəlif neyron alt tipləri (16-19) və nəticədə yaranan neyrodegenerativ fenotip hərəkət pozğunluqları (18, 19) və ya serebellar ataksiya (16) kimi mütərəqqi nevroloji simptomlarla müşayiət olunur. Etiketsiz kəmiyyət (LFQ) proteomikası, metabolomikası, görüntüləmə və virusoloji metodların kombinasiyasından istifadə edərək, mütərəqqi neyrodegenerasiyanın piruvat karboksilaza (PCx) və PN-lərin in vivo arteriosklerozunda iştirak edən digər amilləri güclü şəkildə induksiya etdiyini göstəririk. Fermentlərin ifadəsi. Bu tapıntının aktuallığını yoxlamaq üçün biz xüsusilə Mfn2 çatışmazlığı olan PN-lərdə PCx ifadəsini aşağı saldıq və bu əməliyyatın oksidləşdirici stressi artırdığını və neyrodegenerasiyanı sürətləndirdiyini aşkar etdik, beləliklə, azoospermiyanın hüceyrə ölümünə metabolik uyğunlaşma təmin etdiyini sübut etdik. MFN2-nin ağır ifadəsi, ağır OXPHOS çatışmazlığı, mitoxondrial DNT-nin kütləvi istehlakı və görünür ki, pozulmuş mitoxondrial şəbəkə ilə terminal degenerasiya PN-ni tamamilə xilas edə bilər ki, bu da neyrodegenerasiyanın bu formasının hətta hüceyrə ölümündən əvvəl xəstəliyin inkişaf etmiş mərhələsində də bərpa oluna biləcəyini vurğulayır.
Mfn2 nokaut PN-lərində mitoxondriləri vizuallaşdırmaq üçün Cre-asılı mitoxondrilərin sarı flüoresan zülal (YFP) (mtYFP) (20) Cre ifadəsini hədəf almasına imkan verən siçan ştammından istifadə etdik və mitoxondrial morfologiyanı in vivo yoxladıq. PN-lərdə Mfn2 geninin məhv edilməsinin mitoxondrial şəbəkənin tədricən bölünməsinə səbəb olacağını (Şəkil S1A) və ən erkən dəyişikliyin 3 həftəlik yaşda aşkar edildiyini müəyyən etdik. Bunun əksinə olaraq, Kalbindin immun boyanmasının itirilməsi ilə sübut olunduğu kimi, PN hüceyrə təbəqəsinin əhəmiyyətli dərəcədə degenerasiyası 12 həftəlik yaşdan əvvəl başlamadı (Şəkil 1, A və B). Mitoxondrial morfologiyadakı ən erkən dəyişikliklərlə neyron ölümünün görünən başlanğıcı arasındakı zaman uyğunsuzluğu bizi hüceyrə ölümündən əvvəl mitoxondrial disfunksiyanın tetiklediyi metabolik dəyişiklikləri araşdırmağa sövq etdi. YFP (YFP+) ifadə edən PN-i (Şəkil 1C) və nəzarət siçanlarında (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) təcrid etmək üçün flüoresansla aktivləşdirilmiş hüceyrə çeşidləmə (FACS) əsaslı bir strategiya hazırladıq, bundan sonra CTRL adlandırılacaq (Şəkil S1B). YFP siqnalının nisbi intensivliyinə əsaslanan qapı strategiyasının optimallaşdırılması, konfokal mikroskopla təsdiqlənmiş (Şəkil S1D, sağ), qeyri-PN-lərdən (YFPneg) (Şəkil S1B) və ya ehtimal olunan flüoresan akson/dendritik fraqmentlərdən (YFPlow; Şəkil S1D, sol) YFP+ gövdəsini (YFPhigh) PN-lərdən təmizləməyə imkan verir (Şəkil S1D, sağ). Təsnif edilmiş populyasiyanın kimliyini yoxlamaq üçün LFQ proteomikası və sonra əsas komponent analizi apardıq və YFPhigh və YFPneg hüceyrələri arasında aydın bir ayrılığın olduğunu aşkar etdik (Şəkil S1C). YFPhigh hüceyrələri məlum PN markerlərinin (yəni Calb1, Pcp2, Grid2 və Itpr3) xalis zənginləşməsini göstərdi (21, 22), lakin neyronlarda və ya digər hüceyrə növlərində adətən ifadə olunan zülalların zənginləşdirilməsi müşahidə edilmədi (Şəkil 1D). Müstəqil təcrübələrdə toplanan təsnif edilmiş YFPhigh hüceyrələrindəki nümunələr arasında müqayisə korrelyasiya əmsalının > 0.9 olduğunu göstərdi ki, bu da bioloji replikalar arasında yaxşı təkrarlanma qabiliyyətini nümayiş etdirir (Şəkil S1E). Xülasə, bu məlumatlar mümkün PN-nin kəskin və spesifik təcrid olunması planımızı təsdiqlədi. İstifadə olunan L7-cre sürücü sistemi doğuşdan sonrakı ilk həftədə mozaika rekombinasiyasını induksiya etdiyindən (23), CTRL-dən siçanları çıxarmağa başladıq və şərti (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neyronları topladıq. Rekombinasiya başa çatdıqdan sonra, 4 həftəlik yaşda Mfn2cKO adlanır. Son nöqtə olaraq, mitoxondrial parçalanmaya baxmayaraq, PN təbəqəsinin bütöv olduğu 8 həftəlik yaşı seçdik (Şəkil 1B və Şəkil S1A). Ümumilikdə, cəmi 3013 zülalın miqdarını ölçdük, bunlardan təxminən 22%-i mitoxondrial proteomun mitoxondrial kimi təsvirinə əsaslanan MitoCarta 2.0 annotasiyalarına əsaslanırdı (Şəkil 1E) (Şəkil 1E) (24). 8-ci həftədə aparılan diferensial gen ifadəsi təhlili göstərdi ki, bütün zülalların yalnız 10,5%-də əhəmiyyətli dəyişikliklər olub (Şəkil 1F və Şəkil S1F), bunlardan 195-i aşağı tənzimlənmiş, 120-si isə yuxarı tənzimlənmişdir (Şəkil 1F). Qeyd etmək lazımdır ki, bu məlumat dəstinin "innovativ yol təhlili" diferensial ifadə olunmuş genlərin əsasən məhdud spesifik metabolik yollar dəstinə aid olduğunu göstərir (Şəkil 1G). Maraqlıdır ki, OXPHOS və kalsium siqnalizasiyası ilə əlaqəli yolların aşağı tənzimlənməsi birləşmə çatışmazlığı olan PN-lərdə mitoxondrial disfunksiyanın induksiyasını təsdiqləsə də, əsasən amin turşusu metabolizmasını əhatə edən digər kateqoriyalar əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlir ki, bu da mitoxondrial PN-lərdə baş verən metabolizmə uyğundur. Yenidən naqillərin qurulması ardıcıl olaraq disfunksiyaya səbəb olur.
(A) CTRL və Mfn2cKO siçanlarının beyincik hissələrinin konfokal fotoşəkilləri, PN-lərin mütərəqqi itkisini (kalbindin, boz) göstərir; nüvələr DAPI ilə əks boyanmışdır. (B) (A)-nın kəmiyyətləndirilməsi (diversiyanın birtərəfli təhlili, ***P<0.001; n = üç siçandan 4-dən 6-ya qədər dairə). (C) Eksperimental iş axını. (D) Purkinje (üst) və digər hüceyrə tiplərinə (orta) xas markerlərin istilik xəritəsinin paylanması. (E) Təsnif edilmiş PN-də müəyyən edilmiş mitoxondrial zülalların sayını göstərən Venn diaqramı. (F) 8 həftədə Mfn2cKO neyronlarında differensial ifadə olunmuş zülalların vulkan qrafiki (əhəmiyyət kəsmə dəyəri 1.3). (G) Yaradıcılıq yolu təhlili, 8 həftə kimi təsnif edilmiş Mfn2cKO PN-də ən vacib beş yuxarı tənzimləmə (qırmızı) və aşağı tənzimləmə (mavi) yolunu göstərir. Aşkar edilmiş hər bir zülalın orta ifadə səviyyəsi göstərilir. Boz rəngli istilik xəritəsi: tənzimlənmiş P dəyəri. ns, vacib deyil.
Proteomika məlumatları göstərdi ki, I, III və IV komplekslərinin zülal ifadəsi tədricən azalıb. I, III və IV komplekslərinin hamısında mtDNT ilə kodlanmış əsas alt vahidlər var idi, yalnız nüvə ilə kodlanmış II kompleks isə əsasən təsirlənməyib (Şəkil 2A və Şəkil S2A). . Proteomika nəticələrinə uyğun olaraq, beyincik toxuması bölmələrinin immunohistokimyası göstərdi ki, PN-də IV kompleksinin MTCO1 (mitoxondrial sitoxrom C oksidaza alt vahidi 1) alt vahid səviyyəsi tədricən azalıb (Şəkil 2B). mtDNT ilə kodlanmış Mtatp8 alt vahidi əhəmiyyətli dərəcədə azalıb (Şəkil S2A), nüvə ilə kodlanmış ATP sintaz alt vahidinin sabit vəziyyət səviyyəsi isə dəyişməz qalıb ki, bu da mtDNT ifadəsi sabit olduqda məlum sabit ATP sintaz alt yığımı F1 kompleksi ilə uyğundur. Formalaşma ardıcıldır. Kəsişmə (7). Çeşidlənmiş Mfn2cKO PN-lərində mtDNT səviyyəsinin real vaxt polimeraza zəncirvari reaksiyası (qPCR) ilə qiymətləndirilməsi mtDNT surət sayının tədricən azaldığını təsdiqlədi. Nəzarət qrupu ilə müqayisədə, 8 həftəlik yaşda mtDNT səviyyəsinin yalnız təxminən 20%-i saxlanılıb (Şəkil 2C). Bu nəticələrə uyğun olaraq, DNT-ni aşkar etmək üçün Mfn2cKO PN-lərinin konfokal mikroskopiya boyanması istifadə edildi və bu da mitoxondrial nukleotidlərin zamandan asılı istehlakını göstərdi (Şəkil 2D). Biz mitoxondrial zülalın parçalanmasında və stress reaksiyasında iştirak edən yalnız bəzi namizədlərin, o cümlədən Lonp1, Afg3l2 və Clpx və OXPHOS kompleksinin yığılma amillərinin yüksəldiyini aşkar etdik. Apoptozda iştirak edən zülalların səviyyələrində heç bir əhəmiyyətli dəyişiklik aşkar edilmədi (Şəkil S2B). Eynilə, biz kalsium daşınmasında iştirak edən mitoxondrilərin və endoplazmatik retikulum kanallarının yalnız kiçik dəyişikliklərə malik olduğunu aşkar etdik (Şəkil S2C). Bundan əlavə, autofagiya ilə əlaqəli zülalların qiymətləndirilməsində heç bir əhəmiyyətli dəyişiklik aşkar edilməmişdir ki, bu da immunohistokimya və elektron mikroskopiyası ilə in vivo müşahidə edilən autofaqosomların görünən induksiyası ilə uyğun gəlir (Şəkil S3). Lakin, PN-lərdə mütərəqqi OXPHOS disfunksiyası aşkar ultrastruktur mitoxondrial dəyişikliklərlə müşayiət olunur. 5 və 8 həftəlik Mfn2cKO PN-lərinin hüceyrə gövdələrində və dendritik ağaclarında mitoxondrial klasterlər görünə bilər və daxili membran strukturu dərin dəyişikliklərə məruz qalmışdır (Şəkil S4, A və B). Bu ultrastruktur dəyişikliklərinə və mtDNT-də əhəmiyyətli dərəcədə azalmaya uyğun olaraq, kəskin serebral beyincik dilimlərinin tetrametilrodamin metil esteri (TMRM) ilə təhlili göstərdi ki, Mfn2cKO PN-lərində mitoxondrial membran potensialı əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil S4C).
(A) OXPHOS kompleksinin ifadə səviyyəsinin zaman kursu təhlili. Yalnız 8 həftədə P<0.05 olan zülalları nəzərdən keçirin (iki tərəfli ANOVA). Nöqtəli xətt: CTRL ilə müqayisədə heç bir düzəliş yoxdur. (B) Sol: Anti-MTCO1 antikoru ilə işarələnmiş beyincik kəsiyinin nümunəsi (miqyas zolağı, 20 μm). Purkinje hüceyrə cisimlərinin tutduğu sahə sarı rənglə örtülmüşdür. Sağ: MTCO1 səviyyələrinin kəmiyyətləndirilməsi (birtərəfli dispersiya təhlili; üç siçandan təhlil edilmiş n = 7-dən 20-yə qədər hüceyrə). (C) Çeşidlənmiş PN-də mtDNT surətinin sayının qPCR təhlili (birtərəfli dispersiya təhlili; n = 3-dən 7-yə qədər siçana). (D) Sol: Anti-DNT antikoru ilə işarələnmiş beyincik kəsiyinin nümunəsi (miqyas zolağı, 20 μm). Purkinje hüceyrə cisimlərinin tutduğu sahə sarı rənglə örtülmüşdür. Sağ: mtDNT lezyonlarının kəmiyyətləndirilməsi (diversiyanın birtərəfli təhlili; n = üç siçandan 5-dən 9-a qədər hüceyrə). (E) Bütün hüceyrə yamaq sıxacının qeydində mitoYFP + Purkinje hüceyrələrini göstərən kəskin beyincik kəsiyinin nümunəsi (ox). (F) IV əyrisinin kəmiyyətləndirilməsi. (G) CTRL və Mfn2cKO Purkinje hüceyrələrində depolyarizasiya edən cərəyan inyeksiyasının nümayəndəli qeydləri. Üst iz: AP-ni tetikləyən ilk impuls. Alt iz: Maksimum AP tezliyi. (H) Postsinaptik spontan girişlərin (sPSP) kəmiyyətləndirilməsi. Nümunəvi qeyd izi və onun zum nisbəti (I)-də göstərilmişdir. Üç siçandan n = 5-dən 20-yə qədər hüceyrə təhlil edilən birtərəfli dispersiya təhlili. Məlumatlar orta ±SEM kimi ifadə olunur; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Perforasiyalı yamaq sıxac rejimindən istifadə edərək qeydə alınan spontan AP-nin nümayəndəli izləri. Üst iz: Maksimum AP tezliyi. Alt iz: tək bir AP-nin zumlaması. (K) Orta və maksimum AP tezliyini (J)-yə görə kəmiyyətləşdirin. Mann-Whitney testi; n = 5 hüceyrə dörd siçandan təhlil edildi. Məlumatlar orta ± SEM kimi ifadə olunur; vacib deyil.
8 həftəlik Mfn2cKO PN-də aşkar OXPHOS zədələnməsi aşkar edildi ki, bu da neyronların fizioloji funksiyasının ciddi şəkildə anormal olduğunu göstərir. Buna görə də, kəskin beyincik dilimlərində bütün hüceyrə yamaq sıxac qeydləri apararaq 4-5 həftə və 7-8 həftədə OXPHOS çatışmazlığı olan neyronların passiv elektrik xüsusiyyətlərini təhlil etdik (Şəkil 2E). Gözlənilmədən, hüceyrələr arasında incə fərqlər olsa da, Mfn2cKO neyronlarının orta istirahət membran potensialı və giriş müqaviməti nəzarət qrupuna oxşar idi (Cədvəl 1). Eynilə, 4-5 həftəlik yaşda cərəyan-gərginlik əlaqəsində (IV əyrisi) heç bir əhəmiyyətli dəyişiklik aşkar edilmədi (Şəkil 2F). Lakin, 7-8 həftəlik yaşda heç bir Mfn2cKO neyronu IV rejimdən (hiperpolyarizasiya mərhələsi) sağ çıxmadı ki, bu da bu gec mərhələdə hiperpolyarizasiya potensialına açıq bir həssaslığın olduğunu göstərir. Bunun əksinə olaraq, Mfn2cKO neyronlarında təkrarlanan təsir potensialı (AP) boşalmalarına səbəb olan depolyarizasiya cərəyanları yaxşı tolere edilir, bu da onların ümumi boşalma modellərinin 8 həftəlik nəzarət neyronlarınınkından əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmədiyini göstərir (Cədvəl 1 və Şəkil 2G). Eynilə, spontan postsinaptik cərəyanların (sPSC) tezliyi və amplitudası nəzarət qrupununkuna müqayisə edilə bilərdi və hadisələrin tezliyi oxşar artımla 4 həftədən 5 həftəyə, 7 həftədən 8 həftəyə qədər artdı (Şəkil 2, H və I). PN-lərdə sinaptik yetkinləşmə dövrü (25). Oxşar nəticələr perforasiya olunmuş PN yamalarından sonra əldə edildi. Bu konfiqurasiya, bütün hüceyrə yama sıxacının qeydində baş verə biləcəyi kimi, hüceyrə ATP qüsurlarının mümkün kompensasiyasının qarşısını alır. Xüsusilə, Mfn2cKO neyronlarının istirahət membran potensialı və spontan atəş tezliyi təsirlənmədi (Şəkil 2, J və K). Xülasə, bu nəticələr göstərir ki, aşkar OXPHOS disfunksiyası olan PN-lər yüksək tezlikli boşalma nümunələri ilə yaxşı mübarizə apara bilir və bu da onların demək olar ki, normal elektrofizioloji reaksiyaları saxlamasına imkan verən bir kompensasiya mexanizminin olduğunu göstərir.
Məlumatlar orta ± SEM (dispersiyanın birtərəfli təhlili, Holm-Sidakın çoxsaylı müqayisə testi; *P<0.05) kimi ifadə olunur. Vahid nömrəsi mötərizələrlə göstərilir.
Proteomika məlumat dəstindəki hər hansı bir kateqoriyanın (Şəkil 1G) ağır OXPHOS çatışmazlığını aradan qaldıra bilən yolları əhatə edib-etmədiyini araşdırmağa başladıq və bununla da təsirlənmiş PN-nin niyə normal elektrofiziologiyanı qoruya biləcəyini izah etdik (Şəkil 2, E-dən K-yə). . Proteomika təhlili göstərdi ki, şaxələnmiş zəncirli amin turşularının (BCAA) katabolizmində iştirak edən fermentlər əhəmiyyətli dərəcədə artırılıb (Şəkil 3A və Şəkil S5A) və son məhsul olan asetil-CoA (CoA) və ya suksinil CoA arterioskleroz turşusu (TCA) dövründə trikarboksilatları tamamlaya bilər. BCAA transaminaza 1 (BCAT1) və BCAT2-nin tərkibinin artdığını aşkar etdik. Onlar α-ketoglutaratdan qlutamat əmələ gətirərək BCAA katabolizminin ilk mərhələsini katalizləşdirirlər (26). Şaxələnmiş zəncirli keto turşusu dehidrogenaza (BCKD) kompleksini təşkil edən bütün alt vahidlər yuxarı tənzimlənir (kompleks əmələ gələn BCAA karbon skeletinin sonrakı və dönməz dekarboksilləşməsini katalizləşdirir) (Şəkil 3A və Şəkil S5A). Lakin, çeşidlənmiş PN-də BCAA-nın özündə heç bir aşkar dəyişiklik aşkar edilməmişdir ki, bu da bu vacib amin turşularının hüceyrə tərəfindən mənimsənilməsinin artması və ya TCA dövrünü tamamlamaq üçün digər mənbələrdən (qlükoza və ya süd turşusu) istifadə edilməsi ilə əlaqəli ola bilər (Şəkil S5B). OXPHOS olmayan PN-lərdə də 8 həftəlik yaşda qlutamin parçalanması və transaminasiya aktivliyinin artması müşahidə edilmişdir ki, bu da mitoxondrial fermentlər qlutaminaza (GLS) və qlutamin piruvat transaminaza 2 (GPT2)-nin yuxarı tənzimlənməsi ilə əks oluna bilər (Şəkil 3, A və C). Qeyd etmək lazımdır ki, GLS-in yüksəlməsi birləşdirilmiş izoform qlütaminaza C (GLS-GAC) ilə məhdudlaşır (Mfn2cKO/CTRL-in dəyişməsi təxminən 4,5 dəfədir, P = 0,05) və onun xərçəng toxumalarında spesifik yüksəlməsi mitoxondrial bioenerjini dəstəkləyə bilər (27).
(A) İstilik xəritəsi 8 həftə ərzində göstərilən marşrut üçün zülal səviyyəsindəki qat dəyişikliyini göstərir. (B) Anti-PCx antikoru ilə işarələnmiş beyincik diliminin nümunəsi (miqyas zolağı, 20 μm). Sarı ox Purkinje hüceyrə gövdəsinə işarə edir. (C) Ateroskleroz üçün vacib namizəd kimi müəyyən edilmiş zaman kursu zülal ifadəsi təhlili (çoxlu t-test, *FDR <5%; n = 3-5 siçan). (D) Yuxarıda: [1-13C]piruvat izləyicisində olan işarələnmiş karbonun daxil olmasının müxtəlif yollarını göstərən sxematik diaqram (yəni, PDH və ya trans-arterial marşrut vasitəsilə). Aşağıda: Skripka cədvəli kəskin beyincik dilimlərini [1-13C]piruvatla işarələdikdən sonra aspartik turşuya, limon turşusuna və alma turşusuna çevrilmiş tək işarələnmiş karbonun (M1) faizini göstərir (qoşa t-test; ** P <0.01). (E) Göstərilən yolun hərtərəfli zaman tarixi təhlili. Yalnız 8 həftədə P<0.05 olan zülalları nəzərdən keçirin. Kəsik xətt: düzəliş dəyəri yoxdur (dispersiyanın iki tərəfli təhlili; * P <0.05; *** P <0.001). Məlumatlar orta ± SEM kimi ifadə olunur.
Təhlillərimizdə BCAA katabolizmi əsas yüksəliş yollarından birinə çevrilmişdir. Bu fakt, OXPHOS çatışmazlığı olan PN-də TCA dövrünə daxil olan ventilyasiya həcminin dəyişə biləcəyini güclü şəkildə göstərir. Bu, ağır OXPHOS disfunksiyasının davam etməsi zamanı neyron fiziologiyasına və sağ qalmasına birbaşa təsir göstərə bilən neyron metabolik yenidənqurmanın əsas formasını təmsil edə bilər. Bu hipotezə uyğun olaraq, əsas anti-aterosklerotik ferment PCx-in yüksəlmiş olduğunu (Mfn2cKO/CTRL təxminən 1,5 dəfə dəyişir; Şəkil 3A) aşkar etdik ki, bu da piruvatın beyin toxumasında olduğuna inanılan oksaloasetata çevrilməsini katalizləşdirir (28). ifadəsi astrositlərlə məhdudlaşır (29, 30). Proteomika nəticələrinə uyğun olaraq, konfokal mikroskopiya göstərdi ki, PCx ifadəsi OXPHOS çatışmazlığı olan PN-lərdə xüsusi və əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır, PCx reaktivliyi isə əsasən nəzarət qrupunun bitişik Bergmann qlial hüceyrələri ilə məhdudlaşmışdır (Şəkil 3B). PCx-in müşahidə olunan yüksəlməsini funksional olaraq sınaqdan keçirmək üçün kəskin beyincik dilimlərini [1-13C]piruvat izləyicisi ilə müalicə etdik. Piruvat piruvat dehidrogenaza (PDH) tərəfindən oksidləşdikdə, onun izotop etiketi yox oldu, lakin piruvat damar reaksiyaları ilə metabolizə edildikdə TCA dövrü aralıq məhsullarına daxil olur (Şəkil 3D). Proteomika məlumatlarımızı dəstəkləmək üçün Mfn2cKO dilimlərinin aspartik turşusunda bu izləyicidən çox sayda marker müşahidə etdik, limon turşusu və alma turşusu da əhəmiyyətli olmasa da, orta dərəcədə meyl göstərdi (Şəkil 3D).
MitoPark siçanlarının dopamin neyronlarının mitoxondrial transkripsiya faktoru A genini (Tfam) xüsusi olaraq məhv etməsi nəticəsində yaranan mitoxondrial disfunksiyası olan dopamin neyronlarında (Şəkil S6B) PCx ifadəsi də əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (31), bu da aseton turşusu arteriosklerozunun baş verməsinin bədəndəki neyron OXPHOS-un disfunksiyası zamanı tənzimləndiyini göstərir. Qeyd etmək lazımdır ki, arteriosklerozla əlaqəli ola bilən neyronlarda ifadə oluna bilən unikal fermentlərin (32-34) propionil-CoA karboksilaza (PCC-A), Malonil-CoA propionil-CoA-nı suksinil-CoA-ya çevirir və əsas rolu piruvatı malatdan bərpa etmək olan mitoxondrial alma fermenti 3 (ME3) kimi OXPHOS-da olmayan PN-lərdə əhəmiyyətli dərəcədə artdığı aşkar edilmişdir (Şəkil 3, A və C) (33, 35). Bundan əlavə, PDH-ni fosforlaşdıran və beləliklə, PDH-ni inaktivləşdirən Pdk3 fermentində əhəmiyyətli bir artım aşkar etdik (36), PDH-ni və ya PDH ferment kompleksinin özündə heç bir dəyişiklik aşkar edilmədi (Şəkil 3A). Ardıcıl olaraq, Mern2cKO PN-lərində, Ser293-də PDH kompleksinin piruvat dehidrogenaza E1 komponentinin α1 alt vahidi α (PDHE1α) alt vahidinin fosforlaşması (PDH-nin ferment aktivliyini inhibə etdiyi bilinir) artmışdır (Şəkil S6C) (Şəkil S6C). Piruvatın damar girişi yoxdur.
Nəhayət, hesabatlara görə, aktivləşmə prosesi zamanı serin və qlisin biosintezinin super yolunun, əlaqəli mitoxondrial folat (1C) dövrü və prolin biosintezinin (Şəkil 1G və Şəkil S5C) hamısının əhəmiyyətli dərəcədə yüksəldiyini aşkar etdik. Ətrafdakı toxumalar mitoxondrial disfunksiya ilə aktivləşir (5-7). Bu proteomika məlumatlarını dəstəkləyən konfokal analiz göstərdi ki, OXPHOS çatışmazlığı olan PN-də 8 həftəlik siçanların beyincik dilimləri mitoxondrial folat dövrünün əsas fermenti olan serin hidroksimetiltransferaza 2-yə (SHMT2) məruz qalıb. Əhəmiyyətli immun reaksiya (Şəkil S5D). 13 CU-qlükoza ilə inkubasiya edilmiş kəskin beyincik dilimlərində metabolik izləmə təcrübələri serin və prolin biosintezinin yüksəlməsini daha da təsdiqlədi və bu da karbon izoformlarının serinə və prolinə axınının artdığını göstərir (Şəkil S5E). GLS və GPT2 tərəfindən təşviq edilən reaksiyalar qlütamindən qlütamatın sintezi və qlütamatla α-ketoglutarat arasında transaminasiya üçün məsuliyyət daşıdığından, onların yüksəlməsi OXPHOS çatışmazlığı olan neyronların qlütamata artan tələbatının olduğunu göstərir. Bu, prolinin artan biosintezini qorumağa yönəlmiş ola bilər (Şəkil S5C). Bu dəyişikliklərdən fərqli olaraq, PN-spesifik Mfn2cKO siçanlarından alınan beyincik astrositlərinin proteomik təhlili bu yolların (bütün antiperoksidazlar daxil olmaqla) ifadədə əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmədiyini göstərdi və beləliklə, bu metabolik yönləndirmənin parçalanmış PN-ə selektiv olduğunu göstərir (Şəkil S6, D-dən G-yə).
Xülasə, bu təhlillər PN-lərdə spesifik metabolik yolların müvəqqəti aktivləşməsinin əhəmiyyətli dərəcədə fərqli nümunələrini aşkar etmişdir. Anormal neyron mitoxondrial funksiya erkən ateroskleroza və 1C remodelinqinə (Şəkil 3E və Şəkil S5C) və hətta I və IV komplekslərinin ifadəsində proqnozlaşdırıla bilən dəyişikliklərə səbəb ola bilsə də, serine de novo sintezindəki dəyişikliklər yalnız son mərhələlərdə özünü göstərmişdir. OXPHOS disfunksiyası (Şəkil 3E və Şəkil S5C). Bu tapıntılar stressin yaratdığı mitoxondrial (1C dövrü) və sitoplazmatik (serin biosintezi) reaksiyasının TCA dövründə aterosklerozun artması ilə sinergetik şəkildə neyron metabolizmasını yenidən formalaşdırdığı ardıcıl bir prosesi müəyyən edir.
8 həftəlik OXPHOS çatışmazlığı olan PN-lər yüksək tezlikli həyəcanlanma aktivliyini qoruya və mitoxondrial disfunksiyanı kompensasiya etmək üçün əhəmiyyətli metabolik yenidən əlaqəyə keçə bilər. Bu kəşf, hətta bu anda belə, bu hüceyrələrin neyrodegenerasiyanı gecikdirmək və ya qarşısını almaq üçün terapevtik müdaxilə ala biləcəyi maraqlı bir ehtimal yaradır. Gec. Bu ehtimalı iki müstəqil müdaxilə yolu ilə həll etdik. Birinci metodda, MFN2-nin in vivo OXPHOS çatışmazlığı olan PN-lərdə selektiv şəkildə ifadə edilə bilməsi üçün Cre-asılı adeno ilə əlaqəli virus (AAV) vektoru hazırladıq (Şəkil S7A). MFN2 kodlayan AAV və flüoresans reportyor geni mCherry (Mfn2-AAV) in vitro ilkin neyron kulturalarında təsdiqləndi ki, bu da MFN2-nin Cre-asılı şəkildə ifadə olunmasına səbəb oldu və mitoxondrial morfologiyanı xilas etdi, bununla da Mfn2cKO neyronlarında neyromutasiyanın qarşısını aldı (Şəkil S7, B, D və E). Daha sonra, 8 həftəlik Mfn2-AAV-ı Mfn2cKO və nəzarət siçanlarının beyincik korteksinə stereotaktik şəkildə çatdırmaq üçün in vivo təcrübələr apardıq və 12 həftəlik siçanları təhlil etdik (Şəkil 4A). Müalicə olunmuş Mfn2cKO siçanları öldü (Şəkil 1, A və B) (16). Viral transduksiya in vivo bəzi beyincik dairələrində PN-nin selektiv ifadəsinə səbəb oldu (Şəkil S7, G və H). Yalnız mCherry ifadə edən nəzarət AAV-nın (Ctrl-AAV) inyeksiyası Mfn2cKO heyvanlarında neyrodegenerasiya dərəcəsinə əhəmiyyətli təsir göstərmədi. Bunun əksinə olaraq, Mfn2-AAV ilə transduksiya edilmiş Mfn2cKO-ların təhlili PN hüceyrə təbəqəsinin əhəmiyyətli qoruyucu təsirini göstərdi (Şəkil 4, B və C). Xüsusilə, neyron sıxlığı nəzarət heyvanlarından demək olar ki, fərqlənmir (Şəkil 4, B və C və Şəkil S7, H və I). MFN2-nin deyil, MFN1-in ifadəsi neyron ölümünün qarşısını almaqda eyni dərəcədə təsirlidir (Şəkil 4C və Şəkil S7, C və F), bu da ektopik MFN1-in ifadəsinin MFN2 çatışmazlığını effektiv şəkildə kompensasiya edə biləcəyini göstərir. Tək PN səviyyəsində əlavə təhlillər göstərdi ki, Mfn2-AAV mitoxondrilərin ultrastrukturunu əsasən xilas etdi, mtDNT səviyyələrini normallaşdırdı və anti-angiogenez marker PCx-in yüksək ifadəsini geri qaytardı (Şəkil 4, C-dən E-yə). Xilas edilmiş Mfn2cKO siçanlarının istirahət vəziyyətində vizual müayinəsi onların duruş və motor simptomlarının (hərəkət S1-dən S3-ə) yaxşılaşdığını göstərdi. Nəticə olaraq, bu təcrübələr göstərir ki, OXPHOS-da ciddi çatışmazlıq olan PN-lərə MFN2-nin gecikmiş şəkildə yenidən daxil edilməsi mtDNT istehlakını geri qaytarmaq və aterosklerozu induksiya etmək üçün kifayətdir və bununla da akson degenerasiyasının və neyron ölümünün in vivo qarşısını alır.
(A) Göstərilən metabolik yol aktivləşdirildikdə MFN2 kodlayan AAV inyeksiyası üçün eksperimental cədvəli göstərən sxem. (B) Mfn2cKO siçanlarında 8 həftədə transduksiya edilmiş və anti-Kalbindin antikoru ilə etiketlənmiş 12 həftəlik beyincik dilimlərinin nümayəndəli konfokal şəkilləri. Sağda: Akson liflərinin miqyası. Akson zumunun miqyası 450 və 75 μm-dir. (C) Solda: AAV transduksiya döngəsində (AAV+) Purkinje hüceyrə sıxlığının kəmiyyətləndirilməsi (birtərəfli dispersiya təhlili; n = 3 siçan). Sağda: 12-ci həftədə transduksiya edilmiş PN-də mtDNT fokus təhlili (qoşalaşdırılmamış t-test; n = üç siçandan 6 hüceyrə). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Göstərilən virus vektorları ilə transduksiya edilmiş Mfn2cKO beyincik kəsiklərinin PN-lərinin nümayəndəli ötürmə elektron mikroqrafları. Çəhrayı maska ​​dendritlərin tutduğu sahəni, sarı nöqtəli kvadrat isə sağda verilmiş zumu göstərir; n nüvəni təmsil edir. Ölçü zolağı, 1μm. (E) 12 həftədə transduksiya edilmiş PN-də PCx boyanmasının nümunəsini göstərir. Ölçü zolağı, 20μm. OE, həddindən artıq ifadə; FC, qat dəyişikliyi.
Nəhayət, OXPHOS disfunksiyası yaşayan PN-lərdə peroksidazanın induksiya etdiyi hüceyrə sağ qalmasının əhəmiyyətini araşdırdıq. Xüsusilə siçan PCx mRNA-sını (AAV-shPCx) hədəf alan AAV-shRNA-nı (qısa saçlı RNT) kodlayan mCherry yaratdıq və virusu və ya onun qarışdırılmış nəzarətini (AAV-scr) Mfn2cKO siçanlarının beyinciyinə yeritdik. PCx ifadəsinin artdığı (Şəkil 3C) və PN hüceyrə təbəqəsinin hələ də toxunulmadığı (Şəkil 1A) dövrdə effektiv PCx-in yıxılmasına nail olmaq üçün inyeksiya dördüncü həftədə (Şəkil 5A) həyata keçirildi. Qeyd etmək lazımdır ki, PCx-in yıxılması (Şəkil S8A) yoluxmuş halqa ilə məhdudlaşan PN ölümünün əhəmiyyətli dərəcədə sürətlənməsinə səbəb olur (Şəkil 5, B və C). PCx-in yüksəlmə tənzimlənməsi ilə induksiya olunan metabolik təsirlərin mexanizmini anlamaq üçün, qlütationu qiymətləndirmək üçün PCx knockdown və AAV vasitəçiliyi ilə optik biosensor Grx1-roGFP2 eyni vaxtda ifadə edildikdən sonra PN-lərin redoks statusunu öyrəndik (Şəkil S8, B-dən D-yə), peptid redoks potensialının nisbi dəyişikliyini (38). Daha sonra, FLIM şərtlərini yoxladıqdan sonra sitoplazmatik redoks statusunda potensial dəyişiklikləri aşkar etmək üçün 7 həftəlik Mfn2cKO və ya nəzarət zibil yoldaşlarının kəskin beyin dilimlərində iki fotonlu flüoresan ömürlük görüntüləmə mikroskopiyası (FLIM) apardıq (Şəkil S8, E-dən G-yə). Təhlil, PCx ifadəsi olmayan tək bir Mfn2cKO PN-lərinin oksidləşmə vəziyyətində əhəmiyyətli bir artım göstərdi ki, bu da yalnız qarışdırılmış shRNA ifadə edən nəzarət neyronlarından və ya Mfn2cKO PN-lərindən fərqlidir (Şəkil 5, D və E). PCx ifadəsi aşağı tənzimləndikdə, yüksək oksidləşmə vəziyyəti göstərən Mfn2cKO PN-lərinin faizi üç dəfədən çox artmışdır (Şəkil 5E), bu da PCx-in yuxarı tənzimlənməsinin degenerasiya olunmuş neyronların redoks qabiliyyətini qoruduğunu göstərir.
(A) Göstərilən metabolik yol aktivləşdirildikdə shPCx kodlayan AAV inyeksiyası üçün eksperimental cədvəli göstərən sxem. (B) 4 həftə ərzində transduksiya edilmiş və antikalsineurin antikoru ilə etiketlənmiş Mfn2cKO siçanlarında 8 həftəlik beyincik kəsiklərinin nümayəndəli konfokal fotoşəkilləri. Ölçü zolağı, 450μm. (C) AAV transduksiya edilmiş döngələrdə Purkinje hüceyrə sıxlığının kəmiyyətləndirilməsi (birtərəfli dispersiya təhlili; n = 3-4 siçan). Məlumatlar orta ± SEM kimi ifadə olunur; ***P<0.001. (D) Nümunəvi FLIM şəkli, göstərilən eksperimental şəraitdə 7 həftəlik PN ifadə edən qlütation redoks sensoru Grx1-roGFP2-nin orta ömrünü göstərir. LUT (axtarış cədvəli) nisbəti: sağ qalma müddəti intervalı (pikosaniyələrdə). Ölçü zolağı, 25μm. (E) Histoqram, (D)-dən (hər şərtdə iki siçanda n=158-dən 368-ə qədər hüceyrə) Grx1-roGFP2 ömür dəyərlərinin paylanmasını göstərir. Hər histoqramın üstündəki dairəvi diaqram: CTRL-AAV-scr-də orta ömür dəyərinin 1 SD-ni aşan, əhəmiyyətli dərəcədə uzun (qırmızı, oksidləşmiş) və ya daha qısa (mavi, azalmış) ömür dəyərlərinə malik hüceyrələrin sayını göstərir. (F) Təklif olunan model neyron PCx-in yuxarı tənzimlənməsinin qoruyucu təsirini göstərir.
Ümumilikdə, burada təqdim etdiyimiz məlumatlar göstərir ki, MFN2-nin təkrar ifadəsi ağır OXPHOS çatışmazlığı, ağır mtDNT tükənməsi və son dərəcə anormal iste-bənzər morfologiyası olan inkişaf etmiş PN-ni tamamilə xilas edə bilər və bununla da inkişaf etmiş xəstəliklərdə belə davamlı irəliləyiş təmin edə bilər. Neyrodegenerasiya hüceyrə ölümündən əvvəlki mərhələnin geri dönən sübutlarını təmin edir. Metabolik elastikliyin bu dərəcəsi neyronların aterosklerozu (TCA dövrünün yenidən qurulması) induksiya etmək qabiliyyəti ilə daha da vurğulanır ki, bu da OXPHOS-u olmayan PN-lərdə PCx ifadəsini inhibə edir və hüceyrə ölümünü artırır və bununla da qoruyucu rol oynayır (Şəkil 5F).
Bu tədqiqatda, PN-lərin OXPHOS disfunksiyasına reaksiyasının metabolik proqramlar tərəfindən aktivləşdirilmiş diferensial aktivləşmə yolu vasitəsilə tədricən TCA dövrü aterosklerozuna yaxınlaşması olduğuna dair dəlillər təqdim etdik. Proteomik analizi bir çox tamamlayıcı metodlarla təsdiqlədik və ağır mitoxondrial disfunksiya ilə qarşılaşdıqda neyronların əvvəllər məlum olmayan metabolik elastiklik formasına malik olduğunu aşkar etdik. Təəccüblüdür ki, bütün yenidən qurulma prosesi mütləq tədricən və dönməz şəkildə neyrodegenerasiya ilə müşayiət olunan terminal metabolik vəziyyəti qeyd etmir, lakin məlumatlarımız göstərir ki, o, hətta hüceyrə ölümündən əvvəlki mərhələdə belə bir dəstək neyronu təşkil edə bilər. Funksional kompensasiya mexanizmi. Bu tapıntı neyronların bədəndə əhəmiyyətli dərəcədə metabolik plastikliyə malik olduğunu göstərir. Bu fakt sübut edir ki, MFN2-nin sonrakı yenidən tətbiqi əsas metabolik markerlərin ifadəsini tərsinə çevirə və PN degenerasiyasının qarşısını ala bilər. Əksinə, aterosklerozu inhibə edir və sinirləri sürətləndirir. transseksual.
Tədqiqatımızın ən maraqlı tapıntılarından biri də OXPHOS çatışmazlığı olan PN-lərin arteriosklerozu xüsusi olaraq stimullaşdıran fermentləri artıraraq TCA dövrü metabolizmasını dəyişdirə bilməsidir. Metabolik yenidənqurma xərçəng hüceyrələrinin ümumi xüsusiyyətidir, bəziləri tənəffüs zəncirini hərəkətə gətirən və lipid və nukleotid biosintezi prekursorlarının istehsalını dəstəkləyən reduksiyaedici ekvivalentlər istehsal etmək üçün TCA dövrü aralıqlarını tamamlamaq üçün qlütaminə güvənir (39, 40). Son bir araşdırma göstərdi ki, OXPHOS disfunksiyası yaşayan periferik toxumalarda qlütamin/qlütamat metabolizmasının yenidən birləşməsi də diqqətəlayiq bir xüsusiyyətdir (5, 41), burada qlütaminin TCA dövrünə daxil olma istiqaməti OXPHOS zədələnməsinin şiddətindən asılıdır (41). Bununla belə, bədəndə neyron metabolik plastikliyin hər hansı bir oxşarlığı və xəstəlik kontekstində mümkün əhəmiyyəti barədə aydın dəlil yoxdur. Son bir in vitro tədqiqatda ilkin kortikal neyronların neyrotransmissiya üçün qlütamat hovuzlarını səfərbər etdiyi və bununla da metabolik stress şəraitində oksidləşdirici metabolizmi və aterosklerozu təşviq etdiyi göstərilmişdir (42). Qeyd etmək lazımdır ki, TCA dövrü fermenti olan suksinat dehidrogenazın farmakoloji inhibisyonu altında piruvat karboksilləşməsinin becərilən beyincik dənəvər neyronlarında oksaloasetatın sintezini qoruduğuna inanılır (34). Lakin, bu mexanizmlərin beyin toxuması üçün fizioloji əhəmiyyəti (aterosklerozun əsasən astrositlərlə məhdudlaşdığı düşünülür) hələ də mühüm fizioloji əhəmiyyətə malikdir (43). Bu halda, məlumatlarımız göstərir ki, bədəndə OXPHOS tərəfindən zədələnmiş PN-lər TCA hovuz aralıq məhsullarının əlavə edilməsinin iki əsas mənbəyi olan BCAA deqradasiyasına və piruvat karboksilləşməsinə keçə bilər. BCAA katabolizminin neyron enerji metabolizmasına ehtimal olunan töhfəsi, qlutamat və GABA-nın neyrotransmissiya üçün rolu ilə yanaşı (44) irəli sürülsə də, bu mexanizmlər üçün in vivo hələ də heç bir dəlil yoxdur. Buna görə də, disfunksiyalı PN-lərin aterosklerozu artırmaqla assimilyasiya prosesi tərəfindən idarə olunan TCA aralıq məhsullarının istehlakını avtomatik olaraq kompensasiya edə biləcəyini fərz etmək asandır. Xüsusilə, mitoxondrial disfunksiyası olan proliferasiya edən hüceyrələrdə təklif olunan aspartik turşuya artan tələbatı qorumaq üçün PCx-in yüksəldilməsi tələb oluna bilər (45). Lakin, metabolomika analizimiz Mfn2cKO PN-lərində aspartik turşusunun sabit vəziyyət səviyyəsində heç bir əhəmiyyətli dəyişiklik aşkar etmədi (Şəkil S6A), bu da ehtimal ki, proliferasiya edən hüceyrələr və post-mitotik neyronlar arasında aspartik turşusunun fərqli metabolik istifadəsini əks etdirir. Disfunksiyalı neyronlarda PCx-in yüksəldilməsinin dəqiq mexanizmi in vivo xarakteristikası hələ də müəyyən edilməmiş olsa da, biz bu vaxtından əvvəl reaksiyanın neyronların redoks vəziyyətini qorumaqda mühüm rol oynadığını göstərdik ki, bu da beyincik dilimləri üzərində FLIM təcrübələrində nümayiş etdirilib. Xüsusilə, PN-lərin PCx-i yüksəltməsinin qarşısını almaq daha oksidləşmiş vəziyyətə səbəb ola və hüceyrə ölümünü sürətləndirə bilər. BCAA deqradasiyasının aktivləşməsi və piruvatın karboksilləşməsi mitoxondrial disfunksiyanın periferik toxumalarını xarakterizə etməyin yolları deyil (7). Buna görə də, onlar OXPHOS çatışmazlığı olan neyronların prioritet xüsusiyyəti kimi görünür, hətta yeganə xüsusiyyət olmasa belə, bu, neyrodegenerasiya üçün vacibdir.
Serebellar xəstəliyi, adətən ataksiya kimi özünü göstərən və tez-tez PN-lərə zərər verən heterojen bir neyrodegenerativ xəstəlik növüdür (46). Bu neyron populyasiyası mitoxondrial disfunksiyaya xüsusilə həssasdır, çünki siçanlarda selektiv degenerasiya insan spinocerebellar ataksiyasını xarakterizə edən bir çox motor simptomlarını təkrarlamaq üçün kifayətdir (16, 47, 48). Məlumatlara görə, mutant geni olan transgen siçan modeli insan spinocerebellar ataksiyası ilə əlaqələndirilir və mitoxondrial disfunksiyaya malikdir (49, 50), bu da PNPH-də OXPHOS çatışmazlığının nəticələrinin öyrənilməsinin vacibliyini vurğulayır. Buna görə də, bu unikal neyron populyasiyasını effektiv şəkildə təcrid etmək və öyrənmək xüsusilə uyğundur. Lakin, PN-lərin təzyiqə çox həssas olduğu və bütün serebellar hüceyrə populyasiyasının aşağı bir hissəsini təşkil etdiyi nəzərə alınmaqla, bir çox omikaya əsaslanan tədqiqatlar üçün onların bütöv hüceyrələr kimi selektiv şəkildə ayrılması hələ də çətin bir aspektdir. Digər hüceyrə növlərinin (xüsusən də yetkin toxumaların) çirklənməsinin tamamilə olmamasına nail olmaq demək olar ki, mümkün olmasa da, aşağı axın proteomikası təhlili üçün kifayət qədər sayda canlı neyron əldə etmək üçün effektiv dissosiasiya mərhələsini FACS ilə birləşdirdik və bütün beyinciyin mövcud məlumat dəsti ilə müqayisədə olduqca yüksək protein örtüyünə (təxminən 3000 zülal) sahibik (51). Bütün hüceyrələrin canlılığını qorumaqla, burada təqdim etdiyimiz metod bizə yalnız mitoxondrilərdə metabolik yollardakı dəyişiklikləri yoxlamağa deyil, həm də onun sitoplazmatik həmkarlarındakı dəyişiklikləri yoxlamağa imkan verir ki, bu da hüceyrə tipini zənginləşdirmək üçün mitoxondrial membran etiketlərinin istifadəsini tamamlayır. Mürəkkəb toxumalarda mitoxondrilərin sayı üçün yeni metod (52, 53). Təsvir etdiyimiz metod yalnız Purkinje hüceyrələrinin öyrənilməsi ilə əlaqəli deyil, həm də mitoxondrial disfunksiyanın digər modelləri də daxil olmaqla, xəstə beyinlərdə metabolik dəyişiklikləri həll etmək üçün istənilən hüceyrə növünə asanlıqla tətbiq oluna bilər.
Nəhayət, bu metabolik yenidənqurma prosesi zamanı hüceyrə stressinin əsas əlamətlərini tamamilə aradan qaldıra və neyron degenerasiyasının qarşısını ala bilən terapevtik bir pəncərə müəyyən etdik. Buna görə də, burada təsvir edilən yenidənqurmanın funksional təsirlərini anlamaq, mitoxondrial disfunksiya zamanı neyronların canlılığını qorumaq üçün mümkün müalicə üsulları haqqında fundamental məlumatlar verə bilər. Bu prinsipin digər nevroloji xəstəliklərə tətbiqini tam şəkildə ortaya qoymaq üçün digər beyin hüceyrə növlərində enerji metabolizmasında dəyişiklikləri araşdırmağa yönəlmiş gələcək tədqiqatlar lazımdır.
MitoPark siçanları əvvəllər təsvir edilmişdir (31). LoxP cinahlarında Mfn2 genləri olan C57BL/6N siçanları əvvəllər təsvir edilmişdir (18) və L7-Cre siçanları ilə çarpazlaşdırılmışdır (23). Nəticədə yaranan ikiqat heteroziqot nəsil daha sonra homoziqot Mfn2loxP/Mfn2loxP siçanları ilə çarpazlaşdırılaraq Mfn2 üçün Purkinje-spesifik gen nokautları (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) yaradılmışdır. Çiftleşmenin bir alt qrupunda Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alleli (stop-mtYFP) əlavə çarpazlaşmalar vasitəsilə daxil edilmişdir (20). Bütün heyvan prosedurları Avropa, milli və institusional qaydalara uyğun olaraq həyata keçirilmiş və Şimali Reyn-Vestfaliya, Almaniyanın Umwelt və Verbraucherschutz şəhərlərindən olan LandesamtfürNatur tərəfindən təsdiq edilmişdir. Heyvan işləri həmçinin Avropa Laboratoriya Heyvan Elmləri Assosiasiyaları Federasiyasının rəhbərliyinə uyğun olaraq həyata keçirilir.
Hamilə qadının servikal çıxığı anesteziya edildikdən sonra siçan embrionu təcrid olunur (E13). Korteks 10 mM Hepes ilə zənginləşdirilmiş Hanks Balanslaşdırılmış Duz Məhlulunda (HBSS) parçalandı və papain (20 U/ml) və sistein (1μq/ml) ehtiva edən Dulbecco Modifikasiya olunmuş Qartal Ortamına ötürüldü. Toxumanı DMEM-də inkubasiya edin və fermentativ həzm yolu ilə parçalayın. Ml) 37°C-də 20 dəqiqə ərzində, sonra isə 10% döl mal-qara serumu ilə zənginləşdirilmiş DMEM-də mexaniki olaraq üyüdüldü. Hüceyrələr 6 sm kultura qabında 2×106 sıxlığında və ya görüntüləmə təhlili üçün 0,5×105 hüceyrə/sm2 sıxlığında polilizinlə örtülmüş şüşə örtüklərə əkildi. 4 saatdan sonra mühit 1% B27 əlavəsi və 0,5 mM GlutaMax ehtiva edən Neurobasal serumsuz ortamla əvəz edildi. Neyronlar daha sonra təcrübə boyunca 37°C və 5% CO2 səviyyəsində saxlanıldı və həftədə bir dəfə qidalandırıldı. In vitro rekombinasiyasını stimullaşdırmaq üçün, in vitro ikinci gündə neyronları müalicə etmək üçün aşağıdakı AAV9 virus vektorunun 3μl (24 quyulu kultura qabı) və ya 0.5μl (24 quyulu boşqab) istifadə edildi: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, kataloq nömrəsi 105530-AAV9) və AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, kataloq nömrəsi 105545-AAV9).
Siçan Mfn1 və Mfn2 tamamlayıcı DNT-si (müvafiq olaraq Addgene plazmid #23212 və #23213-dən əldə edilir) C-terminalında V5 ardıcıllığı (GKPIPNPLLGLDST) ilə işarələnir və T2A ardıcıllığı vasitəsilə çərçivədə mCherry ilə birləşdirilir. Grx1-roGFP2, Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) tərəfindən hədiyyədir. Ənənəvi klonlama metodlarından istifadə edərək tdTomato kasetini əvəz etməklə, kaset pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 və pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektorları yaratmaq üçün pAAV-CAG-FLEX-tdTomato onurğasına (Addgene istinad nömrəsi 28306) altklonlaşdırıldı. Oxşar strategiya pAAV-CAG-FLEX-mCherry nəzarət vektorunu yaratmaq üçün istifadə edilmişdir. AAV-shPCx konstruksiyasını yaratmaq üçün, siçan PCx-i hədəf alan shRNA-nı kodlayan DNT ardıcıllığını ehtiva edən plazmid AAV vektoru (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) tələb olunur (5′CTTTCGCTCAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6 promotorunun nəzarəti altında mCherry CMV promotorunun nəzarəti altında istifadə olunur. Köməkçi AAV vektorlarının istehsalı istehsalçının təlimatlarına (Cell Biolabs) uyğun olaraq həyata keçirilmişdir. Qısacası, kalsium fosfat metodundan istifadə edərək, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) daşıyan transfer plazmidindən istifadə edərək 293AAV hüceyrələri-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) və ya Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodlaşdırma genini, eləcə də AAV1 kapsid zülalını və aksesuar zülalını kodlaşdırın. Xam virus supernatantı quru buz/etanol vannasında donma-ərimə dövrləri və fosfat buferli salin məhlulunda (PBS) lizis edilmiş hüceyrələr vasitəsilə əldə edilmişdir. AAV vektoru fasiləsiz yodixanol qradiyentli ultrasentrifuqasiya ilə təmizləndi (32000 dövr/dəq və 4°C-də 24 saat) və Amicon ultra-15 mərkəzdənqaçma filtrindən istifadə edərək konsentrə edildi. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 genom surəti (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX genom titri əvvəllər təsvir edildiyi kimi (54), real vaxt kəmiyyət PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) və AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ilə ölçüldü.
İlkin neyronlar buz kimi soyuq 1x PBS-də qırıntılar şəklində təmizləndi, dənəvərləşdirildi və sonra fosfataza və proteaza inhibitoru (Roche) olan 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksixolat/PBS lizis buferində homogenləşdirildi. Zülalın miqdarı bisinxonin turşusu analizindən (Thermo Fisher Scientific) istifadə etməklə müəyyən edildi. Daha sonra zülallar SDS-poliakrilamid gel elektroforezi ilə ayrıldı və sonra poliviniliden flüorid membranına (GE Healthcare) yapışdırıldı. Qeyri-spesifik sahələri bloklayın və ilkin antikorla (ətraflı məlumat üçün Cədvəl S1-ə baxın) 5% süddə TBST-də (Tween ilə Tris-buferləşdirilmiş salin məhlulu), yuma mərhələlərində və TBST Incubate-də ikincili antikorla inkubasiya edin. Birincili antikorla +4°C-də bir gecə inkubasiya edin. Yuyunduqdan sonra ikincili antikoru otaq temperaturunda 2 saat tətbiq edin. Daha sonra, eyni blotu anti-β-aktin antikoru ilə inkubasiya etməklə eyni yük təsdiqləndi. Kimiluminesensiyaya çevrilməklə və kimiluminesensiyanı gücləndirməklə aşkarlama (GE Healthcare).
Əvvəllər şüşə örtüklərə əkilmiş neyronlar müəyyən edilmiş vaxt nöqtəsində otaq temperaturunda 10 dəqiqə ərzində 4% paraformaldehid (PFA)/PBS ilə fiksasiya edildi. Örtüklər əvvəlcə otaq temperaturunda 5 dəqiqə ərzində 0,1% Triton X-100/PBS ilə hopdurulur, sonra isə bloklayıcı buferdə [3% mal-qara serum albumin (BSA)/PBS] saxlanılır. İkinci gündə örtüklər bloklayıcı buferlə yuyulur və otaq temperaturunda 2 saat ərzində müvafiq flüoroforla birləşdirilmiş ikinci dərəcəli antikorla inkubasiya edilir; nəhayət, nümunələr PBS-də 4′,6-diamidino-2-Fenilindol (DAPI) əks boya ilə yaxşıca yuyulur və sonra Aqua-Poly/Mount ilə mikroskop slaydına fiksasiya edilir.
Siçanlar (erkək və dişi) ketamin (130 mq/kq) və ksilazin (10 mq/kq) qarın boşluğuna yeridilməsi ilə anesteziya edildi və dərialtına karprofen analjezik (5 mq/kq) yeridildi. İsti yastıqla təchiz olunmuş stereotaktik alətə (Kopf) yerləşdirildi. Kəlləni açın və diş qazması ilə beyincik korteksinin mis sümüyə uyğun hissəsini nazikləşdirin (lambdadan: quyruq 1.8, yan 1, IV və V lobullara uyğundur). Aşağıdakı damar sistemini pozmamaq üçün kəllədə diqqətlə kiçik bir dəlik yaratmaq üçün əyri şpris iynəsindən istifadə edin. Daha sonra nazik çəkilmiş şüşə kapilyar yavaş-yavaş mikro dəliyə daxil edilir (dura materin ventral tərəfində -1.3-dən -1-ə qədər) və 10-20 dəqiqəlik bir müddət ərzində əl şprisləri (Narishige) ilə bir neçə dəfə aşağı təzyiq altında mikro injektora (Narishige) 200-300 nl AAV yeridilir. İnfüzyondan sonra, virusun tamamilə yayılmasına imkan vermək üçün kapilyar daha 10 dəqiqə yerləşdirilir. Kapilyarlar çıxarıldıqdan sonra, yara iltihabını minimuma endirmək və heyvanın sağalmasına imkan vermək üçün dəri diqqətlə tikilir. Əməliyyatdan sonra heyvanlar bir neçə gün ərzində ağrıkəsicilərlə (kaspofen) müalicə edildi, bu müddət ərzində onların fiziki vəziyyəti diqqətlə izlənildi və sonra göstərilən vaxtda evtanaziya edildi. Bütün prosedurlar Avropa, milli və institusional qaydalara uyğun olaraq həyata keçirildi və Almaniyanın Şimali Reyn-Vestfaliya əyalətinin Umwelt və Verbraucherschutz şəhərində yerləşən LandesamtfürNatur tərəfindən təsdiq edildi.
Heyvanlar ketamin (100 mq/kq) və ksilazin (10 mq/kq) ilə anesteziya edildi və ürəyə əvvəlcə 0,1 M PBS, sonra isə PBS-də 4% PFA verildi. Toxuma parçalandı və 4°C-də bir gecə ərzində 4% PFA/PBS-də fiksasiya edildi. PBS-də fiksasiya olunmuş beyindən sagittal kəsikləri (50 μm qalınlığında) hazırlamaq üçün titrəyən bıçaq (Leica Microsystems GmbH, Vyana, Avstriya) istifadə edildi. Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, sərbəst üzən kəsiklərin boyanması yuxarıda təsvir edildiyi kimi (13) otaq temperaturunda və qarışdırıldığı kimi aparıldı. Bir sözlə, əvvəlcə əldə edilən dilimlər otaq temperaturunda 15 dəqiqə ərzində 0,5% Triton X-100/PBS ilə permeabilizasiya edildi; bəzi epitoplar (Pcx və Shmt2) üçün 80°C-də (PH 9) tris-EDTA buferində bu addım əvəzinə dilimləri 25 dəqiqə qızdırın. Daha sonra, kəsiklər ilkin antikorla (Cədvəl S1-ə baxın) bloklayıcı buferdə (3% BSA/PBS) 4°C-də gecə qarışdırılaraq inkubasiya edildi. Növbəti gün kəsiklər bloklayıcı buferlə yuyuldu və otaq temperaturunda 2 saat ərzində müvafiq flüoroforla birləşdirilmiş ikincil antikorla inkubasiya edildi; nəhayət, kəsiklər PBS-də yaxşıca yuyuldu, DAPI ilə əks boyandı və sonra mikroskop slaydında AquaPolymount ilə fiksasiya edildi.
Nümunənin görüntüsünü çəkmək üçün ağ işıq lazeri və 405 diodlu ultrabənövşəyi lazerlə təchiz olunmuş lazer skanlama konfokal mikroskopundan (TCS SP8-X və ya TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) istifadə edilmişdir. Flüoroforu həyəcanlandırmaqla və siqnalı Hibrid Detektor (HyDs) ilə toplamaqla, ardıcıl rejimdə Nyquist nümunə götürməsinə uyğun yığılmış şəkilləri toplamaq üçün LAS-X proqram təminatından istifadə edilmişdir: kəmiyyətsiz panellər üçün bu, yüksək dinamik siqnallardır (məsələn, somatik hüceyrələrdə və dendritlərdə) mtYFP). BrightR rejimində PN-lərin sayını aşkar etmək üçün HyD istifadə edin. Fon ölçüsünü azaltmaq üçün 0,3-dən 6 ns-ə qədər qapılama tətbiq olunur.
Çeşidlənmiş hüceyrələrin real vaxt görüntüləməsi. 1% B27 əlavəsi və 0,5 mM GlutaMax ehtiva edən Neurobasal-A mühitində çeşidləndikdən sonra hüceyrələr dərhal poli-l-lizinlə örtülmüş şüşə slaydlara (μ-Slide8 Well, Ibidi, kataloq nömrəsi 80826) əkildi və sonra hüceyrələrin çökməsinə imkan vermək üçün onu 37°C və 5% CO2-də 1 saat saxlayın. Real vaxt görüntüləməsi ağ lazer, HyD, 63×[1.4 ədədi diafraqma (NA)] yağlı obyektiv linzası və qızdırma mərhələsi ilə təchiz olunmuş Leica SP8 lazer skanlama konfokal mikroskopunda aparıldı.
Siçan tez bir zamanda karbon qazı ilə anesteziya edildi və başı kəsildi, beyin tez bir zamanda kəllədən çıxarıldı və aşağıdakı materiallarla doldurulmuş 200 μm qalınlığında (13C etiketləmə təcrübəsi üçün) və ya 275 μm qalınlığında (iki foton təcrübəsi üçün) sagittal hissəyə bölündü. Dondurma (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Almaniya) aşağıdakı maddələrlə doldurulur: 125 mM buz kimi soyuq, karbonla doymuş (95% O2 və 5% CO2) aşağı Ca2 + süni beyin-onurğa mayesi (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfat buferi, 25 mM NaHCO3, 25 mM qlükoza, 0.5 mM CaCl2 və 3.5 mM MgCl2 (osmotik təzyiq 310 ilə 330 mmol arasında). Əldə edilmiş beyin dilimlərini daha yüksək Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-qlükoza, 1.0 mM CaCl2 və 2.0 mM MgCl2) Orta (pH 7.4 və 310-320 mmol) olan inkubasiya öncəsi kameraya köçürün.
Görüntüləmə prosesi zamanı dilimlər xüsusi bir görüntüləmə otağına köçürüldü və təcrübə 32°-dən 33°C-yə qədər sabit temperaturda davamlı ACSF perfuziyası altında aparıldı. Dilim görüntüləməsi üçün Leica 25x obyektiv linzası (NA 0.95, su), Ti: Sapphire lazeri (Chameleon Vision II, Coherent) ilə təchiz olunmuş çoxfotonlu lazer skanlama mikroskopu (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) istifadə edildi. FLIM modulu (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2-nin FLIM-i. PN-lərin sitoplazmatik redoks vəziyyətindəki dəyişikliklər, Grx1-roGFP2 biosensorunun PN-ləri hədəf aldığı sagittal beyin dilimlərində iki fotonlu FLIM ilə ölçüldü. PN təbəqəsində, canlı bir PN-nin (yəni dendritlər boyunca muncuqlu strukturun və ya neyron morfoloji dəyişikliklərinin olmaması) və shRNA PCx və ya onun idarəetmə ardıcıllığını (hər biri mCherry-ni birgə ifadə edən) kodlayan ikiqat müsbət roGFP2 sensoru və AAV-nın olmasını təmin etmək üçün dilim səthindən təxminən 50-80 μm aşağıda əldə etmə sahəsi seçilir. 2x rəqəmsal zumla tək yığımlı şəkillər toplayın [həyəcan dalğa uzunluğu: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Aşkarlama: daxili HyD, flüoresein izotiyosiyanat (FITC) filtr qrupu] və əyri uyğunlaşması üçün kifayət qədər fotonun (cəmi 1000 foton) toplanmasını təmin etmək üçün 2-3 dəqiqə ərzində orta hesabla şəkil istifadə olunur. Grx1-roGFP2 zondunun həssaslığı və FLIM şərtlərinin yoxlanılması, perfuziya ACSF-ə ekzogen 10 mM H2O2 əlavə edildikdə (oksidləşməni maksimum dərəcədə artırmaq və nəticədə ömrün artması) roGFP2-nin ömrünün dəyərini izləməklə və sonra 2 mM ditiotreitol əlavə etməklə (reduksiya dərəcəsini minimuma endirir və nəticədə ömrün azalması ilə nəticələnir) həyata keçirildi (Şəkil S8, D-dən G-yə). Əldə edilən nəticələri təhlil etmək, bütün görüntünün tək eksponensial çürümə əyrisini ölçülmüş IRF-yə (alət cavab funksiyası) uyğunlaşdırmaq üçün FLIMfit 5.1.1 proqram təminatından istifadə edin və χ2 təxminən 1-ə bərabərdir. Tək bir PN-nin ömrünü hesablamaq üçün sinir gövdəsinin ətrafındakı maska ​​əl ilə çəkildi və hər bir maskadakı orta ömür miqdarı kəmiyyətləndirmə üçün istifadə edildi.
Mitoxondrial potensial təhlili. Kəskin hissə perfuziya olunmuş ACSF-ə birbaşa əlavə edilmiş 100 nM TMRM ilə 30 dəqiqə inkubasiya edildikdən sonra, PN-lərin mitoxondrial potensial dəyişiklikləri iki fotonlu mikroskopla ölçüldü. TMRM görüntüləməsi zondu 920 nm-də həyəcanlandırmaqla və siqnalları toplamaq üçün daxili HyD (tetrametilrodamin izotiyosiyanat: 585/40 nm) istifadə etməklə; eyni həyəcan dalğa uzunluğundan istifadə etməklə, lakin mtYFP görüntüləmək üçün fərqli bir daxili HyD (FITC:525/50) istifadə etməklə həyata keçirildi. Tək hüceyrə səviyyəsində mitoxondrial potensialı qiymətləndirmək üçün ImageJ-nin Image Calculator plaginindən istifadə edin. Bir sözlə, plug-in tənliyi: siqnal = min (mtYFP, TMRM) müvafiq kanalın tək yığınlı konfokal görüntüsündə Purkinje Somali-də TMRM siqnalını göstərən mitoxondrial bölgəni müəyyən etmək üçün istifadə olunur. Daha sonra yaranan maskadakı piksel sahəsi kəmiyyətləşdirilir və mitoxondrial potensialı göstərən mitoxondrial fraksiyanı əldə etmək üçün mtYFP kanalının müvafiq eşik tək yığımlı təsvirində normallaşdırılır.
Təsvir Huygens Pro (Elmi Həcm Görüntüsü) proqramı ilə qarışıqlıqdan azad edilib. Plitələrin skan edilmiş şəkilləri üçün tək bir plitə montajı LAS-X proqram təminatı tərəfindən təmin edilən avtomatik tikiş alqoritmindən istifadə etməklə aparılır. Təsvirin kalibrlənməsindən sonra, təsviri daha da emal etmək və parlaqlığı və kontrastı bərabər şəkildə tənzimləmək üçün ImageJ və Adobe Photoshop proqramlarından istifadə edin. Qrafik hazırlığı üçün Adobe Illustrator proqramlarından istifadə edin.
mtDNT fokus analizi. mtDNT lezyonlarının sayı konfokal mikroskop vasitəsilə DNT-yə qarşı antikorlarla işarələnmiş beyincik hissələrində kəmiyyətləndirilmişdir. Hər bir hədəf sahəsi hüceyrə gövdəsi və hər bir hüceyrənin nüvəsi üçün yaradılmış və müvafiq sahə Multi Measure plagini (ImageJ proqram təminatı) istifadə edilərək hesablanmışdır. Sitoplazmatik sahəni əldə etmək üçün nüvə sahəsini hüceyrə gövdəsi sahəsindən çıxarın. Nəhayət, eşik görüntüsündə mtDNT-ni göstərən sitoplazmatik DNT nöqtələrini avtomatik olaraq kəmiyyətləndirmək üçün Analyze Particles plagini (ImageJ proqram təminatı) istifadə edilmişdir və əldə edilən nəticələr CTRL siçanlarının PN ortalamasına normallaşdırılmışdır. Nəticələr hüceyrə başına nukleozidlərin orta sayı kimi ifadə edilir.
Zülal ifadəsi təhlili. Tək hüceyrə səviyyəsində PN-də zülal ifadəsini qiymətləndirmək üçün ImageJ-nin Təsvir Kalkulyatoru plaginindən istifadə edin. Bir sözlə, müvafiq kanalın tək qatlı konfokal təsvirində, siqnal = min (mtYFP, antikor) tənliyi vasitəsilə Purkinada müəyyən bir antikora qarşı immunoreaktivlik göstərən mitoxondrial bölgə müəyyən edilir. Daha sonra nəticədə yaranan maskadakı piksel sahəsi kəmiyyətləşdirilir və sonra göstərilən zülalın mitoxondrial fraksiyasını əldə etmək üçün mtYFP kanalının müvafiq eşik tək yığımlı təsvirində normallaşdırılır.
Purkinje hüceyrə sıxlığının təhlili. ImageJ-in Hüceyrə Sayğacı plagini, sayılmış Purkinje hüceyrələrinin sayını sayılmış hüceyrələr tərəfindən tutulan beyincik halqasının uzunluğuna bölməklə Purkinje sıxlığını qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir.
Nümunənin hazırlanması və toplanması. Nəzarət qrupundan və Mfn2cKO siçanlarından olan beyinlər 0,1 M fosfat buferində (PB) 2% PFA/2,5% qlutaraldehid məhlulunda fiksasiya edildi və sonra koronal kəsiklər kirpiklərdən (Leica Mikrosysteme GmbH, Vyana, Avstriya) istifadə edilərək hazırlandı (Qalınlığı 50-60 μm). Daha sonra otaq temperaturunda 1% os tetraoksid və 1,5% kalium ferrosianid məhlulunda PB buferində 1 saat fiksasiya edildi. Kəsiklər üç dəfə distillə edilmiş su ilə yuyuldu və sonra 20 dəqiqə ərzində 1% uranil asetat tərkibli 70% etanol ilə boyandı. Daha sonra kəsiklər dərəcəli spirtdə susuzlaşdırıldı və silikonla örtülmüş şüşə slaydlar arasında Durcupan ACM (Araldite tökmə qatranı M) epoksi qatranına (Elektron Mikroskopiya Elmləri, kataloq nömrəsi 14040) basdırıldı və nəhayət 60°C-də sobada 48 saat polimerləşdirildi. Beyincik qabığı sahəsi seçildi və 50 nm ultra nazik kəsiklər Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vyana, Avstriya) cihazında kəsildi və polistirol təbəqəsi ilə örtülmüş 2×1 mm mis yarıq torunda seçildi. Kəsiklər 10 dəqiqə ərzində H2O-da 4% uranil asetat məhlulu ilə boyandı, bir neçə dəfə H2O ilə, sonra 10 dəqiqə ərzində H2O-da Reynolds qurğuşun sitratı ilə yuyuldu və sonra bir neçə dəfə H2O ilə yuyuldu. Mikroqraflar TVIPS (Tietz Video və Təsvir Emalı Sistemi) TemCam-F416 rəqəmsal kamerası (TVIPS GmbH, Gauting, ABŞ) istifadə edərək Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABŞ) ötürücü elektron mikroskopu ilə çəkildi.
AAV ilə yoluxmuş siçanlar üçün beyin ayrılmış və 1 mm qalınlığında sagittal hissəyə dilimlənmiş və AAV ilə yoluxmuş halqanı (yəni mCherry ifadə edən) müəyyən etmək üçün beyincik flüoresans mikroskopu istifadə edilərək müayinə edilmişdir. Yalnız AAV inyeksiyasının ən azı iki ardıcıl beyincik halqasında Purkinje hüceyrə təbəqəsinin (yəni demək olar ki, bütün təbəqənin) çox yüksək transduksiya səmərəliliyi ilə nəticələndiyi təcrübələrdən istifadə olunur. AAV ilə ötürülən ilgək gecə ərzində fiksasiya sonrası mikrodisseksiya edilmişdir (0,1 M kakaot buferində 4% PFA və 2,5% qlutaraldehid) və daha da emal edilmişdir. EPON yerləşdirmə üçün fiksasiya olunmuş toxuma 0,1 M natrium kakaot buferi (Applichem) ilə yuyulmuş və 0,1 M natrium kakaot buferində (Applichem) 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ilə 4 saat inkubasiya edilmiş, sonra 2 saat yuyulmuşdur. 0,1 M kokamid buferi ilə 3 dəfə təkrarlayın. Daha sonra, toxumanı susuzlaşdırmaq üçün hər bir etanol məhlulu 4°C-də 15 dəqiqə inkubasiya etmək üçün artan etanol seriyasından istifadə edildi. Toxuma propilen oksidə köçürüldü və 4°C-də EPON-da (Sigma-Aldrich) bir gecədə inkubasiya edildi. Toxumanı otaq temperaturunda 2 saat təzə EPON-a qoyun və sonra 62°C-də 72 saat yerləşdirin. 70 nm ultra nazik kəsikləri kəsmək üçün ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) və almaz bıçağı (Diatome, Biel, İsveçrə) istifadə edin və 37°C-də 15 dəqiqə 1,5% uranil asetatla, 4 dəqiqə isə qurğuşun sitrat məhlulu ilə boyamaq üçün istifadə edin. Elektron mikroqraflar Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) və DigitalMicrograph proqram təminatı (Gatan) ilə təchiz olunmuş JEM-2100 Plus ötürücü elektron mikroskopu (JEOL) istifadə edilərək çəkildi. Təhlil üçün elektron mikroqraflar 5000 × və ya 10.000 × rəqəmsal zumla əldə edilmişdir.
Mitoxondrilərin morfoloji təhlili. Bütün təhlillər üçün fərdi mitoxondrilərin konturları ImageJ proqram təminatından istifadə edərək rəqəmsal şəkillərdə əl ilə qeyd edilmişdir. Müxtəlif morfoloji parametrlər təhlil edilmişdir. Mitoxondrial sıxlıq hər bir hüceyrənin ümumi mitoxondrial sahəsini sitoplazma sahəsinə (sitoplazma sahəsi = hüceyrə sahəsi-hüceyrə nüvəsinin sahəsi) × 100 bölməklə əldə edilən faizlə ifadə olunur. Mitoxondrilərin yuvarlaqlığı [4π∙(sahə/perimetr 2)] düsturu ilə hesablanır. Mitoxondrilərin ista morfologiyası təhlil edilmiş və əsas formalarına görə iki kateqoriyaya (“boruşəkilli” və “blister”) bölünmüşdür.
Autofaqosom/lizosom sayı və sıxlıq təhlili. Rəqəmsal şəkildə hər bir autofaqosom/lizosomun konturlarını əl ilə müəyyən etmək üçün ImageJ proqram təminatından istifadə edin. Autofaqosom/lizosom sahəsi hər hüceyrənin ümumi autofaqosom/lizosom struktur sahəsini sitoplazma sahəsinə bölməklə hesablanan faizlə ifadə olunur (sitoplazma sahəsi=hüceyrə sahəsi-nüvə sahəsi)×100. Autofaqosom/lizosomların sıxlığı ümumi sayı hüceyrədəki autofaqosom/lizosom strukturlarının sayına bölməklə hesablanır (sitoplazmatik sahə = hüceyrə sahəsi-nüvə sahəsi).
Kəskin kəsikləmə və nümunə hazırlanması üçün etiketləmə. Qlükoza etiketləməsini tələb edən təcrübələr üçün kəskin beyin dilimlərini doymuş karbon (95% O2 və 5% CO2), yüksək Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-qlükoza, 1.0 mM CaCl2 və 2.0 mM MgCl2, pH 7.4-ə və 310-dan 320 mOsm-ə qədər tənzimlənmiş) ehtiva edən inkubasiya öncəsi kameraya köçürün, burada qlükoza 13C6-Qlükoza əvəzedicisidir (Eurisotop, kataloq nömrəsi CLM-1396). Piruvat etiketlənməsini tələb edən təcrübələr üçün kəskin beyin dilimlərini daha yüksək Ca2 + ACSF-ə (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-qlükoza, 1.0 mM CaCl2) köçürün və 2.0 mM MgCl2 əlavə edin, pH 7.4-ə və 310-dan 320 mOsm-ə qədər tənzimləyin və 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, kataloq nömrəsi CLM-1082) əlavə edin. Kəsikləri 37°C-də 90 dəqiqə inkubasiya edin. Təcrübənin sonunda kəsiklər tez bir zamanda 75 mM ammonium karbonat ehtiva edən sulu məhlul (pH 7.4) ilə yuyuldu və sonra 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: suda homogenləşdirildi. Kəsiklər buz üzərində 30 dəqiqə inkubasiya edildikdən sonra nümunələr 21000 q-da 4°C-də 10 dəqiqə santrifüj edildi və şəffaf supernatant SpeedVac konsentratorunda quruduldu. Nəticədə qurudulmuş metabolit qranulu analizə qədər -80°C-də saxlanıldı.
13 C-işarəli amin turşusunun maye xromatoqrafiya-kütlə spektrometriyası təhlili. Maye xromatoqrafiya-kütlə spektrometriyası (LC-MS) təhlili üçün metabolit qranulu 75 μl LC-MS dərəcəli suda (Honeywell) yenidən həll edildi. 21000 q-da 4°C-də 5 dəqiqə santrifüqasiyadan sonra amin turşusu axını təhlili üçün 20 μl təmizlənmiş supernatant istifadə edildi, ekstraktın qalan hissəsi isə dərhal anion analizi üçün istifadə edildi (aşağıya baxın). Amin turşusu təhlili əvvəllər təsvir edilmiş benzoil xlorid törəmə protokolundan istifadə etməklə aparıldı (55, 56). İlk addımda 20 μl metabolit ekstraktına 10 μl 100 mM natrium karbonat (Sigma-Aldrich) əlavə edildi və sonra LC dərəcəli ACN-ə 10 μl 2% benzoil xlorid (Sigma-Aldrich) əlavə edildi. Nümunə qısa müddətə vorteks edildi və sonra 21000 q-da 20°C-də 5 dəqiqə santrifüj edildi. Təmizlənmiş supernatantı konik şüşə əlavəli (200 μl həcmdə) 2 ml-lik avtomatik nümunə götürən flakona köçürün. Nümunələr Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) yüksək dəqiqlikli kütlə spektrometrinə (Thermo Fisher Scientific) qoşulmuş Acquity iClass ultra yüksək performanslı LC sistemi (Waters) istifadə edilərək təhlil edildi. Təhlil üçün, törəmə nümunənin 2 μl-i 1,8 μm hissəciklər ehtiva edən 100 × 1,0 mm yüksək möhkəmlikli silisium T3 sütununa (Waters) vuruldu. Axın sürəti 100 μl/dəq-dir və bufer sistemi A buferindən (10 mM ammonium format və suda 0,15% formik turşu) və B buferindən (ACN) ibarətdir. Qradiyent aşağıdakı kimidir: 0 dəqiqədə 0%B; 0%B. 0-dan 0,1 dəqiqəyə qədər 0-dan 15% -ə qədər B; 0,1-dən 0,5 dəqiqəyə qədər 15-dən 17% -ə qədər B; 0,5-dən 14 dəqiqəyə qədər 17-dən 55%-ə qədər B; 14-dən 14,5 dəqiqəyə qədər 55-dən 70%-ə qədər B; 18 dəqiqəyə qədər 14,5-dən 70-ə qədər 100% -ə qədər B; 18-dən 19 dəqiqəyə qədər 100% -ə qədər B; 19-dan 19,1 dəqiqəyə qədər 100-dən 0% -ə qədər B; 19,1-dən 28 dəqiqəyə qədər 0% B (55, 56). QE-HF kütlə spektrometri 50 ilə 750 arasında m/z (kütlə/yük nisbəti) kütlə diapazonu ilə müsbət ionlaşma rejimində işləyir. Tətbiq olunan qətnamə 60.000, əldə edilən gücləndirmə nəzarəti (AGC) ion hədəfi 3×106, maksimum ion müddəti isə 100 millisaniyədir. Qızdırılan elektrosprey ionlaşma (ESI) mənbəyi 3,5 kV püskürtmə gərginliyində, 250°C kapilyar temperaturda, 60 AU (ixtiyari vahidlər) örtük hava axınında və 20 AU 250°C köməkçi hava axınında işləyir. S linzası 60 AU-ya təyin edilib.
13C işarələnmiş üzvi turşuların anion xromatoqrafiyası-MS analizi. Qalan metabolit çöküntüsü (55μl) QE-HF kütlə spektrometrinə (Thermo Fisher Scientific) qoşulmuş Dionex ion xromatoqrafiya sistemi (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) istifadə edilərək təhlil edilmişdir. Bir sözlə, 5μl metabolit ekstraktı, doldurma nisbəti 1 olan qismən dövrə rejimində HPLC (2 mm×250 mm, hissəcik ölçüsü 4μm, Thermo Fisher Scientific) ilə təchiz olunmuş Dionex IonPac AS11-HC sütununa yeridilmişdir.) Dionex IonPac AG11-HC qoruyucu sütun (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Sütunun temperaturu 30°C-də saxlanılır və avtomatik nümunə götürən 6°C-yə təyin edilmişdir. Eluent generatoru vasitəsilə kalium hidroksid qradiyenti yaratmaq üçün deionlaşdırılmış su ilə təchiz olunmuş kalium hidroksid kartricindən istifadə edin. Metabolitlərin 380μl/dəq axın sürəti ilə ayrılması, aşağıdakı qradiyent tətbiq edilməklə: 0-3 dəqiqə, 10 mM KOH; 3-12 dəqiqə, 10-50 mM KOH; 12-19 dəqiqə, 50-100 mM KOH; 19-21 dəqiqə, 100 mM KOH; 21-21.5 dəqiqə, 100-10 mM KOH. Sütun 10 mM KOH altında 8.5 dəqiqə ərzində yenidən balanslaşdırıldı.
Elusiya olunmuş metabolitlər sütundan sonra 150μl/dəq izopropanol əlavə axını ilə birləşdirilir və sonra mənfi ionlaşma rejimində işləyən yüksək dəqiqlikli kütlə spektrometrinə yönəldilir. MS, m/z 50-dən 750-yə qədər kütlə diapazonunu 60.000 dəqiqliklə izləyir. AGC 1×106 olaraq təyin edilib və maksimum ion vaxtı 100 ms-də saxlanılır. Qızdırılmış ESI mənbəyi 3,5 kV-lik püskürtmə gərginliyində işlədilib. İon mənbəyinin digər parametrləri aşağıdakılardır: kapilyar temperatur 275°C; örtük qaz axını, 60 AU; köməkçi qaz axını, 300°C-də 20 AU və S linza parametri 60 AU-ya təyin edilib.
13C etiketli metabolitlərin məlumat təhlili. İzotop nisbətinin məlumat təhlili üçün TraceFinder proqram təminatından (versiya 4.2, Thermo Fisher Scientific) istifadə edin. Hər bir birləşmənin eyniliyi etibarlı istinad birləşməsi ilə təsdiqlənmiş və müstəqil şəkildə təhlil edilmişdir. İzotop zənginləşdirmə təhlili aparmaq üçün hər bir 13C izotopunun (Mn) çıxarılan ion xromatoqramının (XIC) sahəsi [M + H]+ -dan çıxarılmışdır, burada n amin turşularını təhlil etmək üçün istifadə edilən hədəf birləşmənin karbon ədədidir və ya anionları təhlil etmək üçün [MH]+ istifadə olunur. XIC-in kütlə dəqiqliyi milyonda beş hissədən azdır və RT dəqiqliyi 0,05 dəqiqədir. Zənginləşdirmə təhlili aşkar edilmiş hər bir izotopun müvafiq birləşmənin bütün izotoplarının cəminə nisbətini hesablamaqla aparılır. Bu nisbətlər hər bir izotop üçün faiz dəyərləri kimi verilir və nəticələr əvvəllər təsvir edildiyi kimi (42) molar faiz zənginləşdirmə (MPE) kimi ifadə edilir.
Dondurulmuş neyron pellet buz kimi soyuq 80% metanolda (v/v) homogenləşdirildi, vorteks edildi və -20°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edildi. Nümunəni yenidən vorteks edin və +4°C-də 30 dəqiqə qarışdırın. Nümunə 21000 q-da 4°C-də 5 dəqiqə santrifüj edildi və sonra yaranan supernatant toplandı və sonrakı analiz üçün 25°C-də SpeedVac konsentratoru istifadə edilərək quruduldu. Yuxarıda təsvir edildiyi kimi, çeşidlənmiş hüceyrələrin amin turşuları üzərində LC-MS analizi aparıldı. TraceFinder (versiya 4.2, Thermo Fisher Scientific) istifadə edərək, hər bir birləşmənin monoizotopik kütləsindən istifadə edərək məlumatların təhlili aparıldı. Metabolit məlumatlarının kvantil normallaşdırılması preprocessCore proqram paketi (57) istifadə edilərək aparıldı.
Dilim hazırlanması. Siçan tez bir zamanda karbon qazı ilə anesteziya edildi və başı kəsildi, beyin tez bir zamanda kəllədən çıxarıldı və buzla doldurulmuş titrəmə bıçağı (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Almaniya) ilə 300-375 μm sagittal hissələrə kəsildi. Soyuq karbon qazlaşdırma (95% O2 və 5% CO2) Aşağı Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-qlükoza, 1.0 mM CaCl2 və 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 və 310-330 mOsm-ə uyğunlaşdırın). Əldə edilmiş beyin dilimlərini daha yüksək pH 7.4 və 310-320 mOsm olan Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM natrium fosfat buferi, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-qlükoza, 4.0 mM CaCl2 və mM 3.5 MgCl2) olan bir kameraya köçürün. Dilimləri qeyd etməzdən əvvəl bərpa oluna bilməsi üçün 20-30 dəqiqə saxlayın.
qeyd. Bütün qeydlər üçün sabit qeyd kamerası və 20x suya batırma obyektiv linzası (Scientifica) ilə təchiz olunmuş mikroskop mərhələsi istifadə edilmişdir. Ehtimal olunan Purkinje hüceyrələri (i) bədən ölçüsü, (ii) beyinciyin anatomik yeri və (iii) flüoresan mtYFP reportyor geninin ifadəsi ilə müəyyən edilmişdir. Ucluq müqaviməti 5-11 meqohm olan yamaq pipeti borosilikat şüşə kapilyar (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Almaniya) və üfüqi pipet Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA tərəfindən çəkilir. Bütün qeydlər Signal proqram təminatı (versiya 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Böyük Britaniya) tərəfindən idarə olunan ELC-03XS npi yamaq sıxac gücləndiricisi (npi electronic GmbH, Tam, Almaniya) tərəfindən aparılmışdır. Təcrübə 12.5 kHz nümunə götürmə tezliyində qeydə alınmışdır. Siqnal, müvafiq olaraq 1,3 və 10 kHz kəsmə tezliyinə malik iki qısakeçidli Bessel filtri ilə süzülür. Membran və pipetin tutumu gücləndiricidən istifadə edərək kompensasiya dövrəsi ilə kompensasiya olunur. Bütün təcrübələr Hokawo proqram təminatı (versiya 2.8, Hamamatsu, Gerden, Almaniya) tərəfindən idarə olunan Orca-Flash 4.0 kamerasının (Hamamatsu, Gerden, Almaniya) nəzarəti altında aparılmışdır.
Bütün hüceyrənin rutin konfiqurasiyası və təhlili. Qeyd etmədən dərhal əvvəl, pipeti aşağıdakı maddələri ehtiva edən daxili məhlul ilə doldurun: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM kalium qlükonat, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Quanozin trifosfat (GTP) (Na) və 10.0 mM kreatinin fosfat pH 7.25-ə uyğunlaşdırıldı və osmotik təzyiq 290 mOsm (saxaroza) oldu. Membranı yarmaq üçün 0 pA qüvvə tətbiq edildikdən dərhal sonra istirahət membran potensialı ölçüldü. Giriş müqaviməti -40, -30, -20 və -10 pA hiperpolyarlaşdırılmış cərəyanlar tətbiq etməklə ölçülür. Gərginlik reaksiyasının böyüklüyünü ölçün və giriş müqavimətini hesablamaq üçün Om qanunundan istifadə edin. Spontan aktivlik gərginlik sıxacında 5 dəqiqə qeyd edildi və sPSC yarı avtomatik tanıma skriptindən istifadə edərək Igor Pro (versiya 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, ABŞ) proqramında müəyyən edildi və ölçüldü. IV əyrisi və sabit vəziyyət cərəyanı batareyanı müxtəlif potensiallarda (-110 mV-dan başlayaraq) sıxmaqla və gərginliyi 5 mV addımlarla artırmaqla ölçülür. AP istehsalı depolyarizasiya cərəyanı tətbiq etməklə sınaqdan keçirildi. Depolyarizasiya cərəyan impulsu tətbiq edərkən elementi -70 mV-də sıxın. Hər bir qeyd vahidinin addım ölçüsünü ayrıca tənzimləyin (10-dan 60 pA-ya qədər). Ən yüksək AP tezliyinə səbəb olan impuls sıçrayışlarını əl ilə sayaraq maksimum AP tezliyini hesablayın. AP həddi, bir və ya daha çox AP-ni əvvəlcə tetikləyən depolyarizasiya impulsunun ikinci törəməsi istifadə edilərək təhlil edilir.
Deşikli yamaq konfiqurasiyası və təhlili. Standart protokollardan istifadə edərək deşikli yamaq qeydini aparın. Aşağıdakı tərkib hissələrini ehtiva etməyən ATP və GTP-siz pipetdən istifadə edin: 128 mM qlükonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA və 2 mM MgCl2 və pH 7.2-yə (KOH istifadə edərək) uyğunlaşdırın. Hüceyrə membranının nəzarətsiz keçiriciliyinin qarşısını almaq üçün ATP və GTP hüceyrədaxili məhluldan çıxarılır. Deşikli yamaq qeydi əldə etmək üçün yamaq pipeti amfoterisin tərkibli daxili məhlul (təxminən 200-250 μq/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ilə doldurulur. Amfoterisin dimetil sulfoksiddə həll edildi (son konsentrasiyası: 0.1-0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). İstifadə olunan DMSO konsentrasiyası tədqiq olunan neyronlara əhəmiyyətli təsir göstərmədi. Zərbələmə prosesi zamanı kanal müqaviməti (Ra) davamlı olaraq izlənildi və Ra və AP amplitudası sabitləşdikdən sonra (20-40 dəqiqə) təcrübəyə başlanıldı. Spontan aktivlik gərginlik və/və ya cərəyan sıxacında 2-5 dəqiqə ərzində ölçülür. Məlumatların təhlili Igor Pro (versiya 7.05.2, WaveMetrics, ABŞ), Excel (versiya 2010, Microsoft Corporation, Redmond, ABŞ) və GraphPad Prism (versiya 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) istifadə edilərək aparıldı. Spontan AP-ləri müəyyən etmək üçün IgorPro-nun NeuroMatic v3.0c plagini istifadə olunur. Hər bir qeyd üçün fərdi olaraq tənzimlənən müəyyən bir eşik istifadə edərək AP-ləri avtomatik olaraq müəyyən edin. Sıçrayış intervalından istifadə edərək, maksimum ani sıçrayış tezliyi və orta sıçrayış tezliyi ilə sıçrayış tezliyini təyin edin.
PN izolyasiyası. Əvvəllər dərc olunmuş protokola uyğunlaşmaqla, PN-lər müəyyən bir mərhələdə (58) siçan beyinciyindən təmizləndi. Bir sözlə, beyincik buz kimi soyuq dissosiasiya mühitində [HBSS Ca2+ və Mg2+ olmadan, 20 mM qlükoza, penisilin (50 U/ml) və streptomisin (0,05 mq/ml) ilə əlavə edilmiş] parçalandı və xırdalandı, sonra mühit papaində [HBSS, 1-sistein·HCl (1 mq/ml), papain (16 U/ml) və deoksiribonukleaza I (DNase I; 0,1 mq/ml) ilə əlavə edilmiş] həzm edildi. 30°C-də 30 dəqiqə müalicə edildi. Əvvəlcə toxumaları yumurta seliyi (10 mq/ml), BSA (10 mq/ml) və DNase (0.1 mq/ml) olan HBSS mühitində fermentativ həzmin qarşısını almaq üçün otaq temperaturunda yuyun, sonra isə 20 mM qlükoza olan HBSS mühitində HBSS-də yumşaq bir şəkildə üyüdülərək penisilin (50 U/ml), streptomisin (0.05 mq/ml) və DNase (0.1 mq/ml) tək hüceyrələri buraxır. Yaranan hüceyrə suspenziyası 70 μm hüceyrə süzgəcindən süzüldü, sonra hüceyrələr santrifüqasiya (1110 dövr/dəq, 5 dəqiqə, 4°C) ilə dənəvərləşdirildi və çeşidləmə mühitində [20 mM qlükoza, 20% fetal mal-qara) ilə əlavə edilmiş HBSS-də yenidən suspenziya edildi. Serum, penisilin (50 U/ml) və streptomisin (0.05 mq/ml)] yenidən suspenziya edildi; propidium yodid ilə hüceyrənin canlılığını qiymətləndirin və hüceyrə sıxlığını 1 × 106 ilə 2 × 106 hüceyrə/ml arasında tənzimləyin. Axın sitometriyasından əvvəl suspenziya 50 μm hüceyrə süzgəcindən süzülmüşdür.
Axın sitometri. Hüceyrə çeşidlənməsi 4°C-də FACSAria III aparatı (BD Biosciences) və FACSDiva proqram təminatı (BD Biosciences, versiya 8.0.1) istifadə edilərək həyata keçirilmişdir. Hüceyrə suspenziyası 100 μm başlıqdan istifadə edərək 20 psi təzyiq altında ~2800 hadisə/san sürətlə çeşidlənmişdir. Ənənəvi qapılama meyarları (hüceyrə ölçüsü, bimodal fərqləndirmə və səpələnmə xüsusiyyətləri) PN-nin digər hüceyrə növlərindən düzgün təcrid olunmasını təmin edə bilmədiyindən, qapılama strategiyası mitoYFP+ ​​​​və nəzarət mitoYFP − Siçanlarında YFP intensivliyinin və avtoflüoresensiyasının birbaşa müqayisəsinə əsaslanaraq müəyyən edilir. YFP nümunəni 488 nm lazer xətti ilə şüalandırmaqla həyəcanlanır və siqnal 530/30 nm zolaqlı keçid filtri istifadə edilərək aşkar edilir. mitoYFP+ ​​siçanlarında Rosa26-mitoYFP reportyor geninin nisbi gücü də neyron bədəni və akson fraqmentlərini ayırd etmək üçün istifadə olunur. 7-AAD 561 nm sarı lazerlə həyəcanlanır və ölü hüceyrələri istisna etmək üçün 675/20 nm zolaqlı filtrlə aşkar edilir. Astrositləri eyni zamanda ayırmaq üçün hüceyrə suspenziyası ACSA-2-APC ilə boyanmış, sonra nümunə 640 nm lazer xətti ilə şüalandırılmış və siqnalı aşkar etmək üçün 660/20 nm zolaqlı filtrdən istifadə edilmişdir.
Toplanan hüceyrələr santrifüqləmə (1110 dövr/dəq, 5 dəqiqə, 4°C) ilə dənəvərləşdirildi və istifadəyə qədər -80°C-də saxlanıldı. Prosedur dəyişkənliyini minimuma endirmək üçün Mfn2cKO siçanları və onların bala balaları eyni gündə təsnif edilir. FACS məlumatlarının təqdimatı və təhlili FlowJo proqram təminatı (FlowJo MMC, Ashland, Oregon, ABŞ) istifadə edilərək aparıldı.
Yuxarıda qeyd edildiyi kimi (59), sonrakı mtDNT kəmiyyətləndirməsi üçün çeşidlənmiş neyronlardan DNT-ni təcrid etmək üçün real vaxt PCR istifadə olunur. Xəttilik və eşik həssaslığı əvvəlcə müxtəlif sayda hüceyrələrdə qPCR işlədərək sınaqdan keçirilmişdir. Bir sözlə, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 və proteinaza K (200 ng/ml)-dən ibarət lizis buferində 300 PN toplayın və 55°C-də 120 dəqiqə inkubasiya edin. Proteinaza K-nın tam inaktivləşdirilməsini təmin etmək üçün hüceyrələr 95°C-də 10 dəqiqə daha inkubasiya edildi. mt-Nd1-ə xas olan TaqMan zondu (Thermo Fisher) istifadə edərək, mtDNT 7900HT Real-Time PCR sistemində (Thermo Fisher Scientific) yarı-kəmiyyət PCR ilə ölçüldü. Science, kataloq nömrəsi Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, kataloq nömrəsi AIVI3E8) və 18S (Thermo Fisher Scientific, kataloq nömrəsi Hs99999901_s1) genləri.
Proteom nümunəsinin hazırlanması. Məhlulu 95°C-də 10 dəqiqə qızdırmaq və ultrasəslə lizis buferində [6 M quanidin xlorid, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfin hidroxlorid, 10 mM xloroasetamid və 100 mM tris- HCl-də dondurulmuş neyron qranullarını lizis edin]. Bioruptorda (Diagenode) 10 dəqiqə (30 saniyə impuls / 30 saniyə fasilə müddəti) istifadə etməklə. Nümunə 20 mM tris-HCl-də (pH 8.0) 1:10 nisbətində durulaşdırıldı, 300 ng tripsin qızılı (Promega) ilə qarışdırıldı və tam həzmə nail olmaq üçün 37°C-də bir gecə inkubasiya edildi. İkinci gündə nümunə 20.000 q-da 20 dəqiqə santrifüj edildi. Supernatant 0,1% formik turşu ilə durulaşdırıldı və məhlul öz-özünə hazırlanmış StageTips ilə duzsuzlaşdırıldı. Nümunə SpeedVac cihazında (Eppendorf konsentratoru plus 5305) 45°C-də qurudulmuş və sonra peptid 0,1% qarışqa turşusunda suspenziya edilmişdir. Bütün nümunələr eyni şəxs tərəfindən eyni vaxtda hazırlanmışdır. Astrosit nümunələrini təhlil etmək üçün 4 mkq duzsuzlaşdırılmış peptidlər peptid-TMT reaktiv nisbəti 1:20 olan tandem kütlə etiketi (TMT10plex, kataloq nömrəsi 90110, Thermo Fisher Scientific) ilə etiketlənmişdir. TMT etiketlənməsi üçün 0,8 mq TMT reaktivi 70 mkl susuz ACN-də yenidən suspenziya edilmiş və qurudulmuş peptid 9 mkl 0,1 M TEAB (trietilamonium bikarbonat) halına gətirilmiş, üzərinə ACN-də 7 mkl TMT reaktivi əlavə edilmişdir. Konsentrasiya 43,75% təşkil etmişdir. 60 dəqiqəlik inkubasiyadan sonra reaksiya 2 μl 5% hidroksilamin ilə söndürüldü. Etiketlənmiş peptidlər toplandı, quruduldu, 200 μl 0,1% qarışqa turşusunda (FA) yenidən həll edildi, iki hissəyə bölündü və sonra evdə hazırlanmış StageTips istifadə edərək duzsuzlaşdırıldı. UltiMate 3000 ultra yüksək performanslı maye xromatoqrafından (UltiMate 3000 ultra yüksək performanslı maye xromatoqrafı) istifadə edərək, iki yarımdan biri 130Å1.7μm C18 hissəcikləri ilə doldurulmuş 1 mm x 150 mm Acquity xromatoqrafik sütununda fraksiyalaşdırıldı (Waters, kataloq № SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Peptidləri 30μl/dəq axın sürəti ilə ayırın, 1%-dən 50%-ə qədər bufer B-dən 96 dəqiqəlik pilləli qradiyentlə 85 dəqiqə ayırın, 50%-dən 95%-ə qədər bufer B-dən 3 dəqiqə, sonra 95% bufer B üçün 8 dəqiqə ayırın; A buferi 5% ACN və 10 mM ammonium bikarbonatdan (ABC), B buferi isə 80% ACN və 10 mM ABC-dən ibarətdir. Fraksiyaları hər 3 dəqiqədən bir toplayın və onları iki qrupa (1 + 17, 2 + 18 və s.) birləşdirin və vakuum santrifüjündə qurudun.
LC-MS/MS analizi. Kütlə spektrometriyası üçün peptidlər (r119.aq nömrəsi) 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ mühiti (Dr. Maisch, mat) ilə təchiz olunmuş 25 sm, 75 μm daxili diametrli PicoFrit analitik sütununda (yeni obyektiv linza, hissə nömrəsi PF7508250), Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Almaniya) üzərində ayrılmışdır. Sütun 50°C-də saxlanılmışdır. A və B buferləri müvafiq olaraq suda 0.1% qarışqa turşusu və 80% ACN-də 0.1% qarışqa turşusudur. Peptidlər 200 nl/dəq qradiyenti ilə 65 dəqiqə ərzində 6%-dən 31%-ə qədər B buferindən və 31%-dən 50%-ə qədər B buferindən 5 dəqiqə ərzində ayrılmışdır. Elusiya olunmuş peptidlər Orbitrap Fusion kütlə spektrometrində (Thermo Fisher Scientific) təhlil edilmişdir. Peptid prekursorunun m/z ölçülməsi 350 ilə 1500 m/z aralığında 120.000 qətnamə ilə həyata keçirilir. 27% normallaşdırılmış toqquşma enerjisindən istifadə edərək, yüksək enerjili C tələ dissosiasiyası (HCD) parçalanması üçün 2 ilə 6 arasında yük vəziyyətinə malik ən güclü prekursor seçilir. Dövr müddəti 1 saniyə olaraq təyin edilmişdir. Peptid fraqmentinin m/z dəyəri ion tələsində ən kiçik AGC hədəfi olan 5×104 və maksimum inyeksiya müddəti 86 ms istifadə edilərək ölçülmüşdür. Parçalanmadan sonra prekursor 45 saniyə ərzində dinamik istisna siyahısına yerləşdirilmişdir. TMT ilə işarələnmiş peptidlər 50 sm, 75 μm Acclaim PepMap sütununda (Thermo Fisher Scientific, kataloq nömrəsi 164942) ayrılmış və miqrasiya spektrləri yüksək sahəli asimmetrik dalğa forması ionları (FAIMS) avadanlığı (Thermo Fisher Scientific) ilə təchiz olunmuş Orbitrap Lumos Tribrid kütlə spektrometrində (Thermo Fisher Scientific) təhlil edilmişdir. Bu cihaz −50 və −70 V iki kompensasiya gərginliyində işləyir. Sinxronizasiya prekursoruna əsasən seçilmiş MS3, TMT hesabat ion siqnalının ölçülməsi üçün istifadə olunur. Peptid ayrılması, 6%-dən 31%-ə qədər bufer konsentrasiyası ilə 90% xətti qradiyent elüsiyası istifadə edərək EASY-nLC 1200-də aparılmışdır; A buferi 0,1% FA, B buferi isə 0,1% FA və 80% ACN idi. Analitik sütun 50°C-də işləyir. Orijinal faylı FAIMS kompensasiya gərginliyinə görə bölmək üçün FreeStyle (versiya 1.6, Thermo Fisher Scientific) istifadə edin.
Zülalın identifikasiyası və kəmiyyətləndirilməsi. İnteqrasiya olunmuş Andromeda axtarış sistemindən istifadə edərək, orijinal məlumatlar MaxQuant versiyası 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) istifadə edilərək təhlil edilmişdir. Aequorea victoria-dan əldə edilən Cre rekombinaza və YFP ardıcıllıqlarına əlavə olaraq, siçan istinad proteomunun (Proteome ID UP000000589, 2017-ci ilin may ayında UniProt-dan yüklənmişdir) kanonik ardıcıllığı və izoform ardıcıllığı üçün peptid fraqment spektrləri axtarılmışdır. Metionin oksidləşməsi və zülalın N-terminal asetilləşməsi dəyişkən modifikasiyalar kimi təyin edilmişdir; sistein karbamoil metilləşməsi sabit modifikasiyalar kimi təyin edilmişdir. Həzm parametrləri "spesifiklik" və "tripsin/P" olaraq təyin edilmişdir. Zülalın identifikasiyası üçün istifadə edilən peptidlərin və ülgüc peptidlərinin minimum sayı 1-dir; unikal peptidlərin minimum sayı 0-dır. Peptid xəritəsinin uyğunlaşdırılması şərtləri altında zülalın identifikasiya sürəti 0,01 idi. "İkinci Peptid" seçimi aktivdir. Müxtəlif orijinal fayllar arasında uğurlu identifikasiyaları ötürmək üçün "çalışmalar arasında uyğunluq" seçimindən istifadə edin. Etiketsiz kəmiyyətləndirmə (LFQ) üçün LFQ minimum nisbət sayı 1-dən istifadə edin (60). LFQ intensivliyi hər zaman nöqtəsində ən azı bir genotip qrupunda ən azı iki etibarlı dəyər üçün süzülür və eni 0.3 olan normal paylanmadan ekstrapolyasiya edilir və 1.8 aşağı düşür. LFQ nəticələrini təhlil etmək üçün Perseus hesablama platformasından (https://maxquant.net/perseus/) və R-dən (https://r-project.org/) istifadə edin. Diferensial ifadə təhlili üçün limma proqram paketindən iki tərəfli orta t testi istifadə edilmişdir (61). Kəşfiyyat məlumatlarının təhlili ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally və pheatmap istifadə edilərək aparılır. TMT əsaslı proteomika məlumatları MaxQuant versiyası 1.6.10.43 istifadə edilərək təhlil edilmişdir. UniProt-un 2018-ci ilin sentyabr ayında yüklənmiş insan proteomikası verilənlər bazasından xam proteomika məlumatlarını axtarın. Analiz istehsalçı tərəfindən təqdim edilən izotop təmizliyi korreksiya əmsalını ehtiva edir. Diferensial ifadə təhlili üçün R-də limma istifadə edin. Orijinal məlumatlar, verilənlər bazası axtarış nəticələri və məlumatların təhlili iş axını və nəticələri hamısı PXD019690 məlumat dəsti identifikatoru ilə PRIDE tərəfdaş deposu vasitəsilə ProteomeXchange alyansında saxlanılır.
Funksional annotasiyalar təhlili zənginləşdirir. 8 həftəlik məlumat dəstinin funksional annotasiya şərtlərinin zənginliyini müəyyən etmək üçün Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) alətindən istifadə edilmişdir (Şəkil 1). Bir sözlə, LC-MS/MS (tandem kütlə spektrometriyası) məlumat analizindən əldə edilən kəmiyyət zülal siyahısı aşağıdakı filtr meyarları ilə istifadə olunur: Mus musculus növ və fon kimi seçilir və kateqoriya Benjamininin 0,05 və ya daha aşağı zənginləşdirmə üçün düzəliş etdiyi P dəyəri əhəmiyyətli hesab olunur. Bu qrafik üçün hər klasterdə düzəliş edilmiş P dəyərinə əsaslanan ən yaxşı beş artıq kateqoriya göstərilir. Benjamininin, Kriegerin və Yekutielinin iki mərhələli xətti gücləndirmə proqramından (Q = 5%) istifadə edərək çoxsaylı t-testindən istifadə edərək, hər kateqoriyada müəyyən edilmiş vacib namizədlər üzərində zaman kursu zülal ifadəsi təhlili aparılır və hər sətir ayrıca təhlil edilir. Ardıcıl bir SD qəbul etməyə ehtiyac yoxdur.
Bu tədqiqatın nəticələrini dərc olunmuş verilənlər bazaları ilə müqayisə etmək və Şəkil 1-də Venn diaqramı yaratmaq üçün kəmiyyət zülal siyahısını MitoCarta 2.0 annotasiyaları ilə birləşdirdik (24). Diaqramı yaratmaq üçün Draw Venn Diaqram onlayn alətindən (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) istifadə edin.
Proteomika təhlili üçün istifadə olunan statistik prosedurlar haqqında ətraflı məlumat üçün Materiallar və Metodlar bölməsinə baxın. Bütün digər təcrübələr üçün ətraflı məlumat müvafiq əfsanədə tapıla bilər. Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, bütün məlumatlar orta ± SEM kimi ifadə edilir və bütün statistik təhlillər GraphPad Prism 8.1.2 proqram təminatından istifadə etməklə aparılmışdır.
Bu məqalə ilə bağlı əlavə materiallar üçün http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 linkinə baxın.
Bu, son istifadənin kommersiya məqsədi daşımadığı və orijinal əsərin düzgün olması şərtilə istənilən mühitdə istifadəyə, yayılmağa və çoxaldılmasına icazə verən Creative Commons Attribution-Qeyri-Kommersiya Lisenziyasının şərtləri altında paylanan açıq girişli məqalədir. İstinad.
Qeyd: Səhifəyə tövsiyə etdiyiniz şəxsin e-poçtu görməsini istədiyinizi və spam olmadığını bilməsi üçün yalnız e-poçt ünvanınızı təqdim etməyinizi xahiş edirik. Heç bir e-poçt ünvanını qeyd etməyəcəyik.
Bu sual, ziyarətçi olub-olmadığınızı yoxlamaq və avtomatik spam göndərilməsinin qarşısını almaq üçün istifadə olunur.
E. Motori, İ. Atanasov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Disfunksiyalı neyronların proteomik analizi, metabolik proqramların neyrodegenerasiyanın qarşısını almaq üçün aktivləşdirildiyini ortaya qoydu.
E. Motori, İ. Atanasov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Disfunksiyalı neyronların proteomik analizi, metabolik proqramların neyrodegenerasiyanın qarşısını almaq üçün aktivləşdirildiyini ortaya qoydu.
©2020 Elmin İnkişafı üzrə Amerika Assosiasiyası. bütün hüquqlar qorunur. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef və COUNTER-ın tərəfdaşıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.