Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzerin versiyasında CSS dəstəyi məhduddur. Ən yaxşı nəticələr üçün brauzerinizin daha yeni versiyasından istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stil və ya JavaScript olmadan göstəririk.
Propion turşusu (PPA) autizm spektr pozğunluğu kimi neyroinkişaf pozğunluqlarında mitoxondrial disfunksiyanın rolunu öyrənmək üçün istifadə olunur. PPA-nın mitoxondrial biogenez, metabolizm və dövriyyəni pozduğu məlumdur. Lakin, bu mexanizmlərin mürəkkəb zaman təbiəti səbəbindən PPA-nın mitoxondrial dinamikaya, bölünməyə və birləşməyə təsiri problemli olaraq qalır. Burada, PPA-nın neyrona bənzər SH-SY5Y hüceyrələrində mitoxondrial ultrastruktur, morfologiya və dinamikaya necə təsir etdiyini araşdırmaq üçün tamamlayıcı kəmiyyət görüntüləmə üsullarından istifadə edirik. PPA (5 mM) mitoxondrial sahədə (p < 0.01), Feret diametri və çevrəsində (p < 0.05) və 2-ci sahədə (p < 0.01) əhəmiyyətli dərəcədə azalmaya səbəb oldu. Mitoxondrial hadisə lokatorunun təhlili bölünmə və birləşmə hadisələrində əhəmiyyətli bir artım (p < 0.05) göstərdi və bununla da stress şəraitində mitoxondrial şəbəkənin bütövlüyünü qorudu. Bundan əlavə, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) və OPA1 (p < 0.05) mRNA ifadəsi əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır. 01). Bu, stress şəraitində funksiyanı qorumaq üçün mitoxondrial morfologiyanın, biogenezin və dinamikanın yenidən qurulmasını göstərir. Məlumatlarımız PPA-nın mitoxondrial dinamikaya təsirlərinə yeni bir baxış təqdim edir və mitoxondrial stress reaksiyalarında iştirak edən mürəkkəb tənzimləyici mexanizmləri öyrənmək üçün görüntüləmə texnikalarının faydalılığını vurğulayır.
Mitoxondrilər enerji istehsalı və biosintezindəki tipik rollarından əlavə müxtəlif hüceyrə funksiyalarının ayrılmaz iştirakçılarıdır. Mitoxondrial metabolizm kalsium siqnalının, metabolik və redoks homeostazının, iltihab siqnalının, epigenetik modifikasiyaların, hüceyrə proliferasiyasının, differensiasiyasının və proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümünün əsas tənzimləyicisidir1. Xüsusilə, mitoxondrial metabolizm neyronların inkişafı, sağ qalması və funksiyası üçün vacibdir və neyropatologiyanın müxtəlif təzahürlərində geniş şəkildə iştirak edir2,3,4.
Son on ildə metabolik status neyrogenez, differensiasiya, yetkinləşmə və plastikliyin mərkəzi tənzimləyicisi kimi ortaya çıxmışdır5,6. Son zamanlar mitoxondrial morfologiya və dinamika, hüceyrələr daxilində sağlam mitoxondrilər hovuzunu qoruyan dinamik bir proses olan mitozun xüsusilə vacib komponentlərinə çevrilmişdir. Mitoxondrial dinamika, mitoxondrial biogenez və bioenergetikadan mitoxondrial parçalanma, birləşmə, daşınma və təmizlənməyə qədər mürəkkəb qarşılıqlı asılı yollarla tənzimlənir7,8. Bu inteqrativ mexanizmlərdən hər hansı birinin pozulması sağlam mitoxondrial şəbəkələrin saxlanmasına mane olur və neyroinkişaf üçün dərin funksional nəticələrə səbəb olur9,10. Həqiqətən də, mitoxondrial dinamikanın disrequlyasiyası bir çox psixiatrik, neyrodegenerativ və neyroinkişaf pozğunluqlarında, o cümlədən autizm spektr pozğunluqlarında (ASD)11,12 müşahidə olunur.
ASD mürəkkəb genetik və epigenetik arxitekturaya malik heterojen bir neyroinkişaf pozğunluğudur. ASD-nin irsiliyi mübahisəsizdir, lakin əsas molekulyar etiologiyası hələ də zəif başa düşülür. Klinikayaqədərki modellərdən, klinik tədqiqatlardan və multi-omics molekulyar məlumat dəstlərindən toplanan məlumatlar ASD13,14-də mitoxondrial disfunksiyanın artan dəlilini təmin edir. Əvvəllər ASD xəstələrinin bir kohortunda genom genişliyində DNT metilasyon skrininqi apardıq və mitoxondrial metabolik yollar boyunca qruplaşdırılmış differensial metillənmiş genləri müəyyən etdik15. Daha sonra mitoxondrial biogenez və dinamikanın mərkəzi tənzimləyicilərinin differensial metilləşməsini bildirdik ki, bu da ASD16-da mtDNT surətinin sayının artması və sidik metabolik profilinin dəyişməsi ilə əlaqələndirildi. Məlumatlarımız mitoxondrial dinamikanın və homeostazın ASD-nin patofiziologiyasında mərkəzi rol oynadığına dair artan dəlillər təqdim edir. Buna görə də, mitoxondrial dinamika, morfologiya və funksiya arasındakı əlaqənin mexaniki anlaşılmasını yaxşılaşdırmaq, ikincili mitoxondrial disfunksiya ilə xarakterizə olunan nevroloji xəstəliklər üzrə davam edən tədqiqatların əsas məqsədidir.
Molekulyar üsullar tez-tez mitoxondrial stress reaksiyalarında spesifik genlərin rolunu öyrənmək üçün istifadə olunur. Lakin, bu yanaşma mitotik nəzarət mexanizmlərinin çoxşaxəli və zaman xarakteri ilə məhdudlaşa bilər. Bundan əlavə, mitoxondrial genlərin diferensial ifadəsi funksional dəyişikliklərin dolayı göstəricisidir, xüsusən də adətən yalnız məhdud sayda gen təhlil edildiyi üçün. Buna görə də, mitoxondrial funksiyanı və bioenerjini öyrənmək üçün daha birbaşa metodlar təklif edilmişdir17. Mitoxondrial morfologiya mitoxondrial dinamika ilə sıx bağlıdır. Mitoxondrial forma, əlaqə və quruluş enerji istehsalı, mitoxondrial və hüceyrələrin yaşaması üçün vacibdir5,18. Bundan əlavə, mitozin müxtəlif komponentləri mitoxondrial disfunksiyanın faydalı son nöqtələri kimi xidmət edə və sonrakı mexaniki tədqiqatlar üçün əsas yarada bilən mitoxondrial morfologiyadakı dəyişikliklərə diqqət yetirir.
Mitoxondrial morfologiyanı ötürmə elektron mikroskopiyası (TEM) istifadə edərək birbaşa müşahidə etmək olar ki, bu da hüceyrə ultrastrukturunun ətraflı öyrənilməsinə imkan verir. TEM, yalnız hüceyrə populyasiyalarında gen transkripsiyasına, zülal ifadəsinə və ya mitoxondrial funksional parametrlərə əsaslanmaq əvəzinə, fərdi mitoxondrialların həllində mitoxondrial kristalların morfologiyasını, formasını və quruluşunu birbaşa vizuallaşdırır17,19,20. Bundan əlavə, TEM, mitoxondrial funksiyada və homeostazda əsas rol oynayan endoplazmatik retikulum və autofaqosomlar kimi mitoxondrial və digər orqanoidlər arasındakı qarşılıqlı təsirlərin öyrənilməsini asanlaşdırır21,22. Beləliklə, bu, TEM-i müəyyən yollara və ya genlərə diqqət yetirməzdən əvvəl mitoxondrial disfunksiyanı öyrənmək üçün yaxşı bir başlanğıc nöqtəsinə çevirir. Mitoxondrial funksiya neyropatologiya üçün getdikcə daha çox aktuallaşdıqca, in vitro neyron modellərində mitoxondrial morfologiyanı və dinamikanı birbaşa və kəmiyyətcə öyrənə bilmək üçün açıq bir ehtiyac var.
Bu məqalədə, autizm spektr pozğunluğunda mitoxondrial disfunksiyanın neyron modelində mitoxondrial dinamikanı araşdırırıq. Daha əvvəl mitoxondrial propionil-CoA karboksilaza fermenti PCC-nin alt vahidi olan ASD15-də propionil-CoA karboksilaza beta (PCCB)-nin diferensial metilləşməsi barədə məlumat vermişdik. PCC-nin disrequlyasiyasının propion turşusu (PPA)23,24,25 daxil olmaqla propionil törəmələrinin zəhərli yığılmasına səbəb olduğu məlumdur. PPA-nın in vivo neyron metabolizmasını pozduğu və davranışı dəyişdirdiyi göstərilmişdir və ASD26,27,28-də iştirak edən neyroinkişaf mexanizmlərini öyrənmək üçün qurulmuş heyvan modelidir. Bundan əlavə, PPA-nın in vitro mitoxondrial membran potensialını, biogenezini və tənəffüsü pozduğu bildirilmişdir və neyronlarda mitoxondrial disfunksiyanı modelləşdirmək üçün geniş istifadə edilmişdir29,30. Lakin, PPA-nın yaratdığı mitoxondrial disfunksiyanın mitoxondrial morfologiya və dinamikaya təsiri hələ də zəif başa düşülür.
Bu tədqiqat, SH-SY5Y hüceyrələrində PPA-nın mitoxondrial morfologiyaya, dinamikaya və funksiyaya təsirini ölçmək üçün tamamlayıcı görüntüləmə üsullarından istifadə edir. Əvvəlcə, mitoxondrial morfologiya və ultrastrukturdakı dəyişiklikləri vizuallaşdırmaq üçün TEM metodu hazırladıq17,31,32. Mitoxondrilərin33 dinamik təbiətini nəzərə alaraq, PPA stressi altında parçalanma və birləşmə hadisələri, mitoxondrial sayı və həcmi arasındakı tarazlıqdakı dəyişiklikləri ölçmək üçün mitoxondrial hadisə lokalizatoru (MEL) analizindən də istifadə etdik. Nəhayət, mitoxondrial morfologiya və dinamikanın biogenez, parçalanma və birləşmədə iştirak edən genlərin ifadəsindəki dəyişikliklərlə əlaqəli olub olmadığını araşdırdıq. Ümumilikdə, məlumatlarımız mitoxondrial dinamikanı tənzimləyən mexanizmlərin mürəkkəbliyini aydınlaşdırmaq çətinliyini göstərir. SH-SY5Y hüceyrələrində mitozin ölçülə bilən konvergent son nöqtəsi kimi mitoxondrial morfologiyanın öyrənilməsində TEM-in faydalılığını vurğulayırıq. Bundan əlavə, TEM məlumatlarının metabolik stressə cavab olaraq dinamik hadisələri də əks etdirən görüntüləmə üsulları ilə birləşdirildikdə ən zəngin məlumat verdiyini vurğulayırıq. Neyron hüceyrə mitozunu dəstəkləyən molekulyar tənzimləyici mexanizmlərin daha da xarakteristikası sinir sisteminin mitoxondrial komponenti və neyrodegenerativ xəstəliklər haqqında mühüm məlumat verə bilər.
Mitoxondrial stressi yaratmaq üçün SH-SY5Y hüceyrələri 3 mM və 5 mM natrium propionat (NaP) istifadə edərək PPA ilə müalicə edildi. TEM-dən əvvəl nümunələr yüksək təzyiqli dondurma və dondurma istifadə edərək kriogen nümunə hazırlığına məruz qaldı (Şəkil 1a). Üç bioloji replika üzrə mitoxondrial populyasiyaların səkkiz morfoloji parametrini ölçmək üçün avtomatlaşdırılmış mitoxondrial görüntü analizi boru kəməri hazırladıq. PPA müalicəsinin dörd parametri əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirdiyini aşkar etdik: sahə 2, sahə, perimetr və Feret diametri (Şəkil 1b–e). Sahə 2 həm 3 mM, həm də 5 mM PPA müalicəsi ilə əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (müvafiq olaraq p = 0.0183 və p = 0.002) (Şəkil 1b), sahə (p = 0.003), perimetr (p = 0.0106) və Feret diametri isə əhəmiyyətli dərəcədə azaldı. Nəzarət qrupu ilə müqayisədə 5 mM müalicə qrupunda əhəmiyyətli dərəcədə azalma (p = 0.0172) müşahidə edildi (Şəkil 1c–e). Sahə və çevrədəki əhəmiyyətli azalmalar göstərdi ki, 5 mM PPA ilə müalicə olunan hüceyrələrdə mitoxondrilər daha kiçik, daha yuvarlaqlaşdırılmışdır və bu mitoxondrilər nəzarət hüceyrələrindəkilərə nisbətən daha az uzanmışdır. Bu, həmçinin hissəcik kənarları arasındakı ən böyük məsafənin azalmasını göstərən müstəqil parametr olan Feret diametrində əhəmiyyətli dərəcədə azalma ilə uyğun gəlir. Kristaların ultrastrukturunda dəyişikliklər müşahidə edildi: PPA stressinin təsiri altında kristallar daha az nəzərə çarpdı (Şəkil 1a, panel B). Lakin, bütün şəkillər kristalların ultrastrukturunu aydın şəkildə əks etdirmədi, buna görə də bu dəyişikliklərin kəmiyyət təhlili aparılmadı. Bu TEM məlumatları üç mümkün ssenarini əks etdirə bilər: (1) PPA bölünməni gücləndirir və ya birləşməni inhibə edir, mövcud mitoxondrilərin ölçüsünün kiçilməsinə səbəb olur; (2) gücləndirilmiş biogenez yeni, daha kiçik mitoxondrilər yaradır və ya (3) hər iki mexanizmi eyni vaxtda induksiya edir. Bu şərtləri TEM ilə ayırd etmək mümkün olmasa da, əhəmiyyətli morfoloji dəyişikliklər PPA stressi altında mitoxondrial homeostazda və dinamikada dəyişiklikləri göstərir. Daha sonra bu dinamikaları və onların altında yatan potensial mexanizmləri daha da xarakterizə etmək üçün əlavə parametrləri araşdırdıq.
Propion turşusu (PPA) mitoxondrial morfologiyanı yenidən qurur. (a) Mitoxondrial ölçüsünün azaldığını və PPA müalicəsinin artması ilə mitoxondrialların daha kiçik və daha yuvarlaqlaşdığını göstərən reprezentativ ötürmə elektron mikroskopiyası (TEM) şəkilləri; müvafiq olaraq 0 mM (müalicə olunmamış), 3 mM və 5 mM. Qırmızı oxlar mitoxondriləri göstərir. (b–e) 24 saat ərzində PPA ilə müalicə olunmuş SH-SY5Y hüceyrələri TEM üçün hazırlanmışdır və nəticələr Fiji/ImageJ istifadə edərək təhlil edilmişdir. Səkkiz parametrdən dördü nəzarət (müalicə olunmamış, 0 mM PPA) və müalicə olunmuş (3 mM və 5 mM PPA) hüceyrələr arasında əhəmiyyətli fərqlər göstərmişdir. (b) Region 2, (c) Sahə, (d) Perimetr, (e) Feret diametri. Əhəmiyyətli fərqləri müəyyən etmək üçün birtərəfli dispersiya təhlili (nəzarət və müalicə) və Dunnett çoxsaylı müqayisə testi istifadə edilmişdir (p < 0.05). Məlumat nöqtələri hər bir fərdi hüceyrə üçün orta mitoxondrial dəyəri, səhv zolaqları isə orta ± SEM-i təmsil edir. Göstərilən məlumatlar n = 3-ü təmsil edir, hər təkrarlama üçün ən azı 24 hüceyrə; cəmi 266 şəkil təhlil edilib; * p < 0.05-i, ** p < 0.01-i göstərir.
Mitoxondrial dinamikanın PPA-ya necə reaksiya verdiyini daha da xarakterizə etmək üçün mitoxondriləri tetrametilrodamin etil esteri (TMRE) ilə boyadıq və 3 və 5 mM PPA-da 24 saatdan sonra mitoxondriləri lokallaşdırmaq və kəmiyyətləndirmək üçün zaman fasiləsi mikroskopiyası və MEL analizindən istifadə etdik. Bölünmə və birləşmə hadisələrinin müalicəsi. (Şəkil 2a). MEL analizindən sonra mitoxondrial strukturların sayını və onların orta həcmini kəmiyyətləndirmək üçün mitoxondrilər əlavə olaraq təhlil edildi. 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)]-də baş verən bölünmə hadisələrinin sayında kiçik, lakin əhəmiyyətli bir artım müşahidə etdik, bu da bölünmə [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)) və birləşmə [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] və birləşmə [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] <0.05)] hadisələri ilə müqayisədə 5 mM-də əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 3b). Mitoxondrilərin sayı həm 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)], həm də 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)]-də əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 3c), hər bir mitoxondrial strukturun orta həcmi isə dəyişməz qalmışdır (Şəkil 3c). 3d). Ümumilikdə, bu, mitoxondrial dinamikanın yenidən modelləşdirilməsinin mitoxondrial şəbəkənin bütövlüyünü uğurla qoruyan kompensator cavab kimi xidmət etdiyini göstərir. 3 mM PPA-da parçalanma hadisələrinin sayının artması, mitoxondrial sayının artmasının qismən mitoxondrial parçalanma ilə əlaqəli olduğunu göstərir, lakin orta mitoxondrial həcmin əsasən dəyişməz qaldığını nəzərə alsaq, biogenezin əlavə kompensator cavab kimi istisna edilə bilməyəcəyini göstərir. Lakin, bu məlumatlar TEM tərəfindən müşahidə edilən daha kiçik, yuvarlaq mitoxondrial strukturlarla uyğun gəlir və həmçinin PPA tərəfindən induksiya edilən mitoxondrial dinamikada əhəmiyyətli dəyişiklikləri nümayiş etdirir.
Propion turşusu (PPA) şəbəkə bütövlüyünü qorumaq üçün dinamik mitoxondrial remodelləşməni stimullaşdırır. SH-SY5Y hüceyrələri becərilmiş, 24 saat ərzində 3 və 5 mM PPA ilə işlənmiş və TMRE və Hoechst 33342 ilə boyanmış, ardınca MEL analizi aparılmışdır. (a) Hər bir vəziyyət üçün 2-ci vaxtda (t2) rəngli və binarlaşdırılmış maksimum intensivlik proyeksiyalarını əks etdirən nümunəvi zaman fasiləsi mikroskopiyası şəkilləri. Hər ikili şəkildə göstərilən seçilmiş bölgələr zamanla dinamikanı göstərmək üçün üç fərqli zaman çərçivəsində (t1-t3) gücləndirilmiş və 3D formatında göstərilir; birləşmə hadisələri yaşıl rənglə vurğulanmışdır; parçalanma hadisələri yaşıl rənglə vurğulanmışdır. Qırmızı rənglə göstərilir. (b) Hər vəziyyət üçün dinamik hadisələrin orta sayı. (c) Hər hüceyrə üçün mitoxondrial strukturların orta sayı. (d) Hər hüceyrə üçün hər mitoxondrial strukturun orta həcmi (µm3). Göstərilən məlumatlar müalicə qrupu üçün n = 15 hüceyrəni təmsil edir. Göstərilən xəta zolaqları orta ± SEM-i təmsil edir, miqyas zolağı = 10 μm, * p < 0.05.
Propion turşusu (PPA) mitoxondrial dinamika ilə əlaqəli genlərin transkripsiya basqısına səbəb olur. SH-SY5Y hüceyrələri 24 saat ərzində 3 və 5 mM PPA ilə müalicə edildi. Nisbi gen kəmiyyətləndirməsi RT-qPCR istifadə edilərək aparıldı və B2M-ə normallaşdırıldı. Mitoxondrial biogenez genləri (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 və (d) NFE2L2. Mitoxondrial birləşmə və bölünmə genləri (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 və (i) DRP1. Əhəmiyyətli fərqlər (p < 0.05) birtərəfli ANOVA (nəzarət və müalicə) və Dunnett çoxsaylı müqayisə testi istifadə edilərək sınaqdan keçirildi: * p < 0.05, ** p < 0.01 və **** p < 0.0001 göstərir. Sütunlar orta ifadə ± SEM-i təmsil edir. Göstərilən məlumatlar n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) və n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) bioloji replikaları təmsil edir.
TEM və MEL analizlərindən alınan məlumatlar birlikdə PPA-nın mitoxondrial morfologiyanı və dinamikanı dəyişdirdiyini göstərir. Lakin, bu görüntüləmə üsulları bu prosesləri idarə edən əsas mexanizmlər haqqında məlumat vermir. Buna görə də, PPA müalicəsinə cavab olaraq mitoxondrial dinamikanın, biogenezin və mitozun doqquz əsas tənzimləyicisinin mRNT ifadəsini araşdırdıq. Hüceyrə miyelomu onkogenini (cMYC), nüvə tənəffüs faktorunu (NRF1), mitoxondrial transkripsiya faktoru 1-i (TFAM), NFE2-yə bənzər transkripsiya faktoru BZIP-i (NFE2L2), qastrin kimi protein 2-ni (STOML2), optik sinir atrofiyası 1-i (OPA1), Mitofusin 1-i (MFN1), Mitofusin 2-ni (MFN2) və dinaminlə əlaqəli protein 1-i (DRP1) 24 saatlıq müalicədən sonra ölçdük. Biz 3 mM (müvafiq olaraq p = 0.0053, p = 0.0415 və p < 0.0001) və 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA müalicəsini müşahidə etdik. (Şəkil 3a–c). mRNA ifadəsinin azalması dozadan asılı idi: cMYC, NRF1 və TFAM ifadəsi 3 mM-də müvafiq olaraq 5.7, 2.6 və 1.9 dəfə, 5 mM-də isə 11.2, 3 və 2.2 dəfə azalıb. Bunun əksinə olaraq, mərkəzi redoks biogenez geni NFE2L2 PPA-nın heç bir konsentrasiyasında dəyişdirilmədi, baxmayaraq ki, ifadənin azalmasında oxşar dozadan asılı tendensiya müşahidə edildi (Şəkil 3d).
Həmçinin, parçalanma və birləşmənin tənzimlənməsində iştirak edən klassik genlərin ifadəsini araşdırdıq. STOML2-nin birləşmə, mitofagiya və biogenezdə iştirak etdiyi düşünülür və onun ifadəsi 3 mM (2,4 dəfə dəyişiklik) və 5 mM (2,8 dəfə dəyişiklik) PPA ilə əhəmiyyətli dərəcədə azalıb (p < 0,0001) (Şəkil 1). 3d). Eynilə, OPA1 birləşmə geninin ifadəsi 3 mM (1,6 dəfə dəyişiklik) və 5 mM (1,9 dəfə dəyişiklik) PPA-da (müvafiq olaraq p = 0,006 və p = 0,0024) azalıb (Şəkil 3f). Lakin, 24 saatlıq PPA stressi altında birləşmə genləri MFN1, MFN2 və ya bölünmə gen DRP1-in ifadəsində əhəmiyyətli fərqlər tapmadıq (Şəkil 3g–i). Bundan əlavə, dörd birləşmə və parçalanma zülalının (OPA1, MFN1, MFN2 və DRP1) səviyyələrinin eyni şərtlər altında dəyişmədiyini aşkar etdik (Şəkil 4a–d). Qeyd etmək vacibdir ki, bu məlumatlar tək bir zaman nöqtəsini əks etdirir və PPA stressinin erkən mərhələlərində zülal ifadəsindəki və ya aktivlik səviyyələrindəki dəyişiklikləri əks etdirməyə bilər. Bununla belə, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 və OPA1 ifadəsində əhəmiyyətli azalmalar mitoxondrial metabolizma, biogenez və dinamikanın əhəmiyyətli transkripsiya disrequlyasiyasını göstərir. Bundan əlavə, bu məlumatlar mitoxondrial funksiyadakı son vəziyyət dəyişikliklərini birbaşa öyrənmək üçün görüntüləmə texnikalarının faydalılığını vurğulayır.
Propion turşusu (PPA) müalicəsindən sonra birləşmə və parçalanma faktoru zülal səviyyələri dəyişməyib. SH-SY5Y hüceyrələri 24 saat ərzində 3 və 5 mM PPA ilə müalicə olunub. Zülal səviyyələri Western blot analizi ilə ölçülüb və ifadə səviyyələri ümumi zülala normallaşdırılıb. Orta zülal ifadəsi və hədəf və ümumi zülalın təmsilçi Western blotları göstərilib. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Sütunlar orta ± SEM-i təmsil edir və göstərilən məlumatlar n = 3 bioloji təkrarlamanı təmsil edir. Çoxsaylı müqayisələr (p < 0.05) birtərəfli dispersiya analizi və Dunnett testi istifadə edilərək aparılıb. Orijinal gel və blot Şəkil S1-də göstərilib.
Mitoxondrial disfunksiya metabolik, ürək-damar və əzələ xəstəliklərindən tutmuş nevroloji xəstəliklərə qədər müxtəlif sistemli xəstəliklərlə əlaqələndirilir1,10. Bir çox neyrodegenerativ və neyrodegenerativ xəstəliklər mitoxondrial disfunksiya ilə əlaqələndirilir ki, bu da beynin ömrü boyu bu orqanoidlərin əhəmiyyətini vurğulayır. Bu xəstəliklərə Parkinson xəstəliyi, Alzheimer xəstəliyi və ASD3,4,18 daxildir. Lakin, bu xəstəlikləri öyrənmək üçün beyin toxumasına çıxış çətindir, xüsusən də mexaniki səviyyədə, bu da hüceyrə model sistemlərini zəruri alternativə çevirir. Bu tədqiqatda, neyron xəstəliklərində, xüsusən də autizm spektr pozğunluqlarında müşahidə olunan mitoxondrial disfunksiyanı təkrarlamaq üçün PPA ilə müalicə olunmuş SH-SY5Y hüceyrələrindən istifadə edən hüceyrə model sistemindən istifadə edirik. Neyronlarda mitoxondrial dinamikanı öyrənmək üçün bu PPA modelindən istifadə ASD-nin etiologiyası haqqında məlumat verə bilər.
Mitoxondrial morfologiyadakı dəyişiklikləri görmək üçün TEM-dən istifadə imkanlarını araşdırdıq. Qeyd etmək vacibdir ki, TEM-in effektivliyini maksimum dərəcədə artırmaq üçün düzgün istifadə edilməlidir. Krio-nümunələrin hazırlanması, eyni zamanda hüceyrə komponentlərini fiksasiya etməklə və artefaktların əmələ gəlməsini azaltmaqla neyron strukturlarının daha yaxşı qorunmasına imkan verir34. Bununla uyğun olaraq, neyrona bənzər SH-SY5Y hüceyrələrinin bütöv hüceyrəaltı orqanoidlərə və uzadılmış mitoxondrilərə malik olduğunu müşahidə etdik (Şəkil 1a). Bu, neyron hüceyrə modellərində mitoxondrial morfologiyanı öyrənmək üçün kriogen hazırlıq texnikalarının faydalılığını vurğulayır. Kəmiyyət ölçmələri TEM məlumatlarının obyektiv təhlili üçün vacib olsa da, mitoxondrial morfoloji dəyişiklikləri təsdiqləmək üçün hansı konkret parametrlərin ölçülməsi barədə hələ də fikir birliyi yoxdur. Mitoxondrial morfologiyanı kəmiyyətcə araşdıran çoxsaylı tədqiqatlara əsaslanaraq17,31,32, səkkiz morfoloji parametri, yəni: sahə, sahə2, aspekt nisbəti, perimetr, dairəvilik, dərəcə, Feret diametri və yuvarlaqlığı ölçən avtomatlaşdırılmış mitoxondrial görüntü analizi boru kəməri hazırladıq.
Bunların arasında PPA 2-ci sahəni, sahəni, perimetri və Feret diametrini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır (Şəkil 1b–e). Bu, mitoxondrilərin daha kiçik və daha yuvarlaq hala gəldiyini göstərdi ki, bu da 72 saatlıq PPA30-un yaratdığı mitoxondrial stressdən sonra mitoxondrial sahədə azalma göstərən əvvəlki tədqiqatlarla uyğun gəlir. Bu morfoloji xüsusiyyətlər mitoxondrial parçalanmanı göstərə bilər ki, bu da zədələnmiş komponentləri mitoxondrial şəbəkədən ayırmaq və onların mitofagiya yolu ilə parçalanmasını təşviq etmək üçün zəruri bir prosesdir35,36,37. Digər tərəfdən, orta mitoxondrial ölçünün azalması artan biogenez ilə əlaqələndirilə bilər ki, bu da kiçik yeni yaranan mitoxondrilərin əmələ gəlməsinə səbəb olur. Artan parçalanma və ya biogenez mitoxondrial stressə qarşı mitozu qorumaq üçün kompensator cavabdır. Lakin, azalmış mitoxondrial böyümə, pozulmuş birləşmə və ya digər şərtlər istisna edilə bilməz.
TEM tərəfindən yaradılan yüksək qətnaməli şəkillər fərdi mitoxondrilər səviyyəsində morfoloji xüsusiyyətlərin müəyyən edilməsinə imkan versə də, bu metod tək bir nöqtədə ikiölçülü görüntülər yaradır. Metabolik stressə dinamik reaksiyaları öyrənmək üçün mitoxondriləri TMRE ilə boyadıq və MEL analizi ilə zaman fasiləsi mikroskopiyasından istifadə etdik ki, bu da zamanla mitoxondrial şəbəkədəki dəyişikliklərin yüksək məhsuldarlıqlı 3D vizuallaşdırılmasına imkan verir33,38. PPA stressi altında mitoxondrial dinamikada incə, lakin əhəmiyyətli dəyişikliklər müşahidə etdik (Şəkil 2). 3 mM-də parçalanma hadisələrinin sayı əhəmiyyətli dərəcədə artdı, birləşmə hadisələri isə nəzarətdəki ilə eyni qaldı. 5 mM PPA-da həm parçalanma, həm də birləşmə hadisələrinin sayında artım müşahidə edildi, lakin bu dəyişikliklər təxminən mütənasib idi, bu da parçalanma və birləşmə kinetikasının daha yüksək konsentrasiyalarda tarazlığa çatdığını göstərir (Şəkil 2b). Orta mitoxondrial həcm həm 3, həm də 5 mM PPA-da dəyişməz qaldı, bu da mitoxondrial şəbəkənin bütövlüyünün qorunub saxlanıldığını göstərir (Şəkil 2d). Bu, dinamik mitoxondrial şəbəkələrin şəbəkə parçalanmasına səbəb olmadan homeostazı effektiv şəkildə qorumaq üçün mülayim metabolik stressə cavab vermək qabiliyyətini əks etdirir. 3 mM PPA-da parçalanmanın artması yeni bir tarazlığa keçidi təşviq etmək üçün kifayətdir, lakin PPA-nın daha yüksək konsentrasiyalarının yaratdığı stressə cavab olaraq daha dərin kinetik yenidənqurma tələb olunur.
Hər iki PPA stress konsentrasiyasında mitoxondrilərin sayı artmışdır, lakin orta mitoxondrial həcm əhəmiyyətli dərəcədə dəyişməmişdir (Şəkil 2c). Bu, biogenezin artması və ya bölünmənin artması ilə əlaqəli ola bilər; lakin, orta mitoxondrial həcmdə əhəmiyyətli bir azalma olmadığı təqdirdə, biosintezin artması ehtimalı daha yüksəkdir. Bununla belə, Şəkil 2-dəki məlumatlar iki kompensasiya mexanizminin mövcudluğunu dəstəkləyir: mitoxondrial bölünmənin artması ilə uyğun gələn bölünmə hadisələrinin sayının artması və mitoxondrial biogenez ilə uyğun gələn hadisələrin sayının artması. Nəticədə, yüngül stress üçün dinamik kompensasiya bölünmə, birləşmə, biogenez və mitofagiyanı əhatə edən eyni vaxtda proseslərdən ibarət ola bilər. Əvvəlki müəlliflər PPA-nın mitozu30,39 və mitofagiya29 gücləndirdiyini göstərsələr də, biz PPA-ya cavab olaraq mitoxondrial bölünmənin və birləşmə dinamikasının yenidən qurulması üçün dəlillər təqdim edirik. Bu məlumatlar TEM tərəfindən müşahidə edilən morfoloji dəyişiklikləri təsdiqləyir və PPA-nın yaratdığı mitoxondrial disfunksiya ilə əlaqəli mexanizmlərə daha ətraflı nəzər salmağa imkan verir.
Nə TEM, nə də MEL analizləri müşahidə olunan morfoloji dəyişikliklərin əsasını təşkil edən gen tənzimləyici mexanizmlərinə dair birbaşa dəlil təqdim etmədiyindən, mitoxondrial metabolizm, biogenez və dinamikada iştirak edən genlərin RNT ifadəsini araşdırdıq. cMYC proto-onkogeni mitoxondrial transkripsiya, qlikoliz, amin turşusu və yağ turşusu metabolizmasının tənzimlənməsində iştirak edən transkripsiya amilidir40. Bundan əlavə, cMYC-nin NRF1 və TFAM41 də daxil olmaqla mitoxondrial transkripsiya, tərcümə və kompleks yığımda iştirak edən təxminən 600 mitoxondrial genin ifadəsini tənzimlədiyi məlumdur. NRF1 və TFAM, mtDNT replikasiyasını aktivləşdirmək üçün PGC-1α-dan aşağı axında hərəkət edən mitozun iki mərkəzi tənzimləyicisidir. Bu yol cAMP və AMPK siqnalı ilə aktivləşdirilir və enerji sərfiyyatına və metabolik stressə həssasdır. PPA-nın təsirlərinin oksidləşdirici stresslə vasitəçilik edilib-edilmədiyini müəyyən etmək üçün mitoxondrial biogenezin redoks tənzimləyicisi olan NFE2L2-ni də araşdırdıq.
NFE2L2 ifadəsi dəyişməz qalsa da, 3 mM və 5 mM PPA ilə 24 saatlıq müalicədən sonra cMYC, NRF1 və TFAM ifadəsində ardıcıl dozadan asılı azalma müşahidə etdik (Şəkil 3a–c). cMYC ifadəsinin aşağı tənzimlənməsi əvvəllər mitoxondrial stressə cavab olaraq bildirilmişdir42 və əksinə, cMYC ifadəsinin aşağı tənzimlənməsi mitoxondrial metabolizmanı, şəbəkə bağlantısını və membran polyarizasiyasını yenidən modelləşdirməklə mitoxondrial disfunksiyaya səbəb ola bilər43. Maraqlıdır ki, cMYC həmçinin mitoxondrial parçalanma və birləşmənin tənzimlənməsində iştirak edir42,43 və hüceyrə bölünməsi zamanı DRP1 fosforlaşmasını və mitoxondrial lokalizasiyanı artırdığı, həmçinin neyron kök hüceyrələrində mitoxondrial morfoloji yenidən modelləşdirməni vasitəçilik etdiyi məlumdur45. Həqiqətən də, cMYC çatışmazlığı olan fibroblastlar PPA43 stressinin yaratdığı dəyişikliklərə uyğun olaraq mitoxondrial ölçüdə azalma nümayiş etdirir. Bu məlumatlar cMYC və mitoxondrial dinamika arasında maraqlı, lakin hələlik aydın olmayan bir əlaqəni göstərir və PPA stressindən qaynaqlanan remodelinqin gələcək tədqiqatları üçün maraqlı bir hədəf təmin edir.
NRF1 və TFAM-ın azalması cMYC-nin mühüm transkripsiya aktivatoru kimi rolu ilə uyğundur. Bu məlumatlar həmçinin insan yoğun bağırsaq xərçəngi hüceyrələrində aparılan əvvəlki tədqiqatlarla da uyğundur ki, PPA 22 saat ərzində NRF1 mRNA ifadəsini azaltmışdır ki, bu da ATP tükənməsi və ROS46-nın artması ilə əlaqələndirilmişdir. Bu müəlliflər həmçinin TFAM ifadəsinin 8,5 saatda artdığını, lakin 22 saatda baza səviyyələrinə qayıtdığını bildirmişlər. Bunun əksinə olaraq, Kim və digərləri (2019) SH-SY5Y hüceyrələrində 4 saatlıq PPA stressindən sonra TFAM mRNA ifadəsinin əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını göstərmişdir; lakin, 72 saatdan sonra TFAM zülal ifadəsi əhəmiyyətli dərəcədə artmış və mtDNA surətinin sayı əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır. Beləliklə, 24 saatdan sonra müşahidə etdiyimiz mitoxondrial biogenez genlərinin sayının azalması, mitoxondrilərin sayının artmasının daha erkən zaman nöqtələrində biogenezin aktivləşməsi ilə əlaqəli olması ehtimalını istisna etmir. Əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, PPA 4 saat 30 dəqiqədə SH-SY5Y hüceyrələrində PGC-1α mRNA və zülalını əhəmiyyətli dərəcədə artırır, propion turşusu isə 12 saat 39 dəqiqədə PGC-1α vasitəsilə buzov hepatositlərində mitoxondrial biogenezi gücləndirir. Maraqlıdır ki, PGC-1α yalnız NRF1 və TFAM-ın birbaşa transkripsiya tənzimləyicisi deyil, həm də parçalanma və birləşməni tənzimləyərək MFN2 və DRP1-in fəaliyyətini tənzimlədiyi göstərilmişdir47. Ümumilikdə, bu, PPA tərəfindən induksiya edilən mitoxondrial kompensator reaksiyaları tənzimləyən mexanizmlərin sıx əlaqəsini vurğulayır. Bundan əlavə, məlumatlarımız PPA stressi altında biogenez və metabolizmin transkripsiya tənzimlənməsinin əhəmiyyətli dərəcədə pozulmasını əks etdirir.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 və DRP1 genləri mitoxondrial parçalanma, birləşmə və dinamikanın mərkəzi tənzimləyiciləri arasındadır37,48,49. Mitoxondrial dinamikada iştirak edən bir çox başqa gen var, lakin STOML2, OPA1 və MFN2-nin əvvəllər ASD kohortlarında fərqli şəkildə metilləşdiyi aşkar edilmişdir16 və bir neçə müstəqil tədqiqat mitoxondrial stressə cavab olaraq bu transkripsiya amillərində dəyişikliklər barədə məlumat vermişdir50,51.52. Həm OPA1, həm də STOML2-nin ifadəsi 3 mM və 5 mM PPA müalicəsi ilə əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil 3e, f). OPA1, MFN1 və 2 ilə birbaşa qarşılıqlı təsir yolu ilə mitoxondrial birləşmənin klassik tənzimləyicilərindən biridir və kristalların yenidən qurulmasında və mitoxondrial morfologiyada rol oynayır53. STOML2-nin mitoxondrial dinamikada dəqiq rolu hələ də aydın deyil, lakin dəlillər onun mitoxondrial birləşmədə, biogenezdə və mitofagiyada rol oynadığını göstərir.
STOML2 mitoxondrial tənəffüs əlaqəsinin qorunmasında və tənəffüs zənciri komplekslərinin əmələ gəlməsində iştirak edir54,55 və xərçəng hüceyrələrinin metabolik xüsusiyyətlərini dərindən dəyişdirdiyi göstərilmişdir56. Tədqiqatlar göstərir ki, STOML2 BAN və kardiolipinlə qarşılıqlı təsir vasitəsilə mitoxondrial membran potensialını və biogenezini təşviq edir55, 57, 58. Bundan əlavə, müstəqil tədqiqatlar göstərir ki, STOML2 və PINK1 arasındakı qarşılıqlı təsir mitofagiyanı tənzimləyir59,60. Xüsusilə, STOML2-nin MFN2 ilə birbaşa qarşılıqlı təsir göstərdiyi və onu sabitləşdirdiyi, həmçinin OPA1 parçalanmasından məsul olan proteazı inhibə etməklə uzun OPA1 izoformlarının sabitləşməsində mühüm rol oynadığı bildirilir53,61,62. PPA reaksiyalarında müşahidə olunan STOML2 ifadəsinin azalması bu birləşmə zülallarını ubikvitin və proteazomdan asılı yollar vasitəsilə parçalanmaya daha həssas edə bilər48. STOML2 və OPA1-in PPA-ya dinamik reaksiyada dəqiq rolu bəlli olmasa da, bu birləşmə genlərinin ifadəsinin azalması (Şəkil 3) bölünmə və birləşmə arasındakı tarazlığı poza və mitoxondrial ölçünün azalmasına səbəb ola bilər (Şəkil 3). 1).
Digər tərəfdən, OPA1 zülalının ifadəsi 24 saatdan sonra dəyişməz qalıb, MFN1, MFN2 və ya DRP1-in mRNA və zülal səviyyələri isə PPA müalicəsindən sonra əhəmiyyətli dərəcədə dəyişməyib (Şəkil 3g-i, Şəkil 4). Bu, mitoxondrial birləşmə və parçalanma ilə əlaqəli bu amillərin tənzimlənməsində heç bir dəyişiklik olmadığını göstərə bilər. Bununla belə, qeyd etmək lazımdır ki, bu dörd genin hər biri də zülal aktivliyini idarə edən posttranskripsiya modifikasiyaları (PTM) ilə tənzimlənir. OPA1-in mitoxondrilərdə proteolitik şəkildə parçalanan səkkiz alternativ splays variantı var ki, bunlar iki fərqli izoform 63 əmələ gətirir. Uzun və qısa izoformlar arasındakı tarazlıq nəticə etibarilə OPA1-in mitoxondrial birləşmədə və mitoxondrial şəbəkənin saxlanılmasında rolunu müəyyən edir64. DRP1 aktivliyi kalsium/kalmodulindən asılı protein kinaz II (CaMKII) fosforilləşməsi ilə tənzimlənir, DRP1-in parçalanması isə ubikvitinləşmə və SUMOilləşmə ilə tənzimlənir65. Nəhayət, həm DRP1, həm də MFN1/2 GTPazlardır, buna görə də aktivliyə mitoxondrilərdə GTP istehsal sürəti təsir göstərə bilər 66. Buna görə də, bu zülalların ifadəsi sabit qalsa da, bu, dəyişməmiş zülal aktivliyini və ya lokalizasiyasını əks etdirməyə bilər 67,68. Həqiqətən də, mövcud PTM zülal repertuarları tez-tez kəskin stress reaksiyalarının vasitəçiliyindən məsul olan ilk müdafiə xətti kimi xidmət edir. Modelimizdə orta metabolik stressin olması halında, PTM-nin mRNT və ya zülal səviyyəsində bu genlərin əlavə aktivləşdirilməsini tələb etmədən mitoxondrial bütövlüyü kifayət qədər bərpa etmək üçün birləşmə və parçalanma zülallarının artan aktivliyini təşviq etməsi ehtimalı var.
Yuxarıdakı məlumatlar birlikdə götürüldükdə mitoxondrial morfologiyanın mürəkkəb və zamandan asılı tənzimlənməsini və bu mexanizmlərin aydınlaşdırılmasındakı çətinlikləri vurğulayır. Gen ifadəsini öyrənmək üçün əvvəlcə yolda spesifik hədəf genləri müəyyən etmək lazımdır. Lakin, məlumatlarımız göstərir ki, eyni yolda olan genlər eyni stressə eyni şəkildə cavab vermir. Əslində, əvvəlki tədqiqatlar eyni yolda olan müxtəlif genlərin fərqli zaman reaksiyası profilləri nümayiş etdirə biləcəyini göstərmişdir30,46. Bundan əlavə, transkripsiya və gen funksiyası arasındakı əlaqəni pozan mürəkkəb post-transkripsiya mexanizmləri mövcuddur. Proteomik tədqiqatlar PTM-lərin və zülal funksiyasının təsirinə dair məlumat verə bilər, lakin onlar həmçinin aşağı ötürmə qabiliyyəti metodları, yüksək siqnal-səs-küy nisbətləri və zəif qətnamə kimi çətinliklər yaradır.
Bu kontekstdə, TEM və MEL istifadə edərək mitoxondrial morfologiyanın öyrənilməsi, mitoxondrial dinamika ilə funksiya arasındakı əlaqə və bunun xəstəliyə necə təsir etməsi ilə bağlı fundamental sualları həll etmək üçün böyük potensiala malikdir. Ən əsası, TEM, mitoxondrial disfunksiya və dinamikanın konvergent son nöqtəsi kimi mitoxondrial morfologiyanı ölçmək üçün birbaşa metod təqdim edir51. MEL həmçinin üçölçülü hüceyrə mühitində parçalanma və birləşmə hadisələrini vizuallaşdırmaq üçün birbaşa metod təqdim edir və gen ifadəsində dəyişikliklər olmadığı halda belə dinamik mitoxondrial remodelinqin kəmiyyətləndirilməsinə imkan verir33. Burada ikinci dərəcəli mitoxondrial xəstəliklərdə mitoxondrial görüntüləmə texnikalarının faydalılığını vurğulayırıq. Bu xəstəliklər adətən kəskin mitoxondrial zədələnmədən daha çox mitoxondrial şəbəkələrin incə remodelinqi ilə xarakterizə olunan xroniki yüngül metabolik stress ilə xarakterizə olunur. Lakin, xroniki stress altında mitozu qorumaq üçün tələb olunan mitoxondrial kompensasiya dərin funksional nəticələrə malikdir. Neyrologiya kontekstində bu kompensasiya mexanizmlərinin daha yaxşı başa düşülməsi, mitoxondrial disfunksiya ilə əlaqəli pleiotrop neyropatologiya haqqında vacib məlumatlar verə bilər.
Nəticə etibarilə, məlumatlarımız, neyron mitoxondrial dinamikasını idarə edən gen ifadəsi, zülal modifikasiyaları və zülal aktivliyi arasındakı mürəkkəb qarşılıqlı təsirlərin funksional nəticələrini anlamaq üçün görüntüləmə texnikalarının faydalılığını vurğulayır. ASD-nin mitoxondrial komponenti haqqında məlumat əldə etmək üçün neyron hüceyrə modelində mitoxondrial disfunksiyanı modelləşdirmək üçün PPA-dan istifadə etdik. PPA ilə müalicə olunan SH-SY5Y hüceyrələri mitoxondrial morfologiyada dəyişikliklər göstərdi: mitoxondrilər kiçik və yuvarlaq hala gəldi və TEM ilə müşahidə edildikdə kristallar zəif müəyyən edildi. MEL analizi göstərir ki, bu dəyişikliklər yüngül metabolik stressə cavab olaraq mitoxondrial şəbəkəni qorumaq üçün bölünmə və birləşmə hadisələrinin artması ilə eyni vaxtda baş verir. Bundan əlavə, PPA mitoxondrial metabolizma və homeostazın transkripsiya tənzimlənməsini əhəmiyyətli dərəcədə pozur. Biz cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 və OPA1-i PPA stressi ilə pozulan əsas mitoxondrial tənzimləyicilər kimi müəyyən etdik və mitoxondrial morfologiya və funksiyada PPA-nın yaratdığı dəyişikliklərin vasitəçiliyində rol oynaya bilər. Gen ifadəsində və zülal aktivliyində, lokalizasiyada və translyasiya sonrası modifikasiyalarda PPA-nın yaratdığı müvəqqəti dəyişiklikləri daha yaxşı xarakterizə etmək üçün gələcək tədqiqatlara ehtiyac var. Məlumatlarımız mitoxondrial stress reaksiyasını vasitəçilik edən tənzimləyici mexanizmlərin mürəkkəbliyini və qarşılıqlı asılılığını vurğulayır və daha hədəflənmiş mexaniki tədqiqatlar üçün TEM və digər görüntüləmə texnikalarının faydalılığını nümayiş etdirir.
SH-SY5Y hüceyrə xətti (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrich-dən alınmışdır. SH-SY5Y hüceyrələri Dulbecco-nun modifikasiya olunmuş Eagle mühiti/F-12 qida qarışığında (DMEM/F-12) və L-qlütamin (SC09411, ScienCell) 25 sm2-lik kolbalarda 20% fetal mal-qara serumu (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) və 1% penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ilə zənginləşdirilmiş şəkildə 37 °C, 5% CO2-də yetişdirilmişdir. Hüceyrələr 0,05% tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) istifadə edərək 80% birləşmə nöqtəsinə qədər subkulturasiya edilmiş, 300 q-da santrifüj edilmiş və təxminən 7 × 105 hüceyrə/ml sıxlığında örtülmüşdür. Bütün təcrübələr 19-22 keçidləri arasında differensiasiya olunmamış SH-SY5Y hüceyrələri üzərində aparılmışdır. PPA NaP kimi tətbiq olunur. NaP tozunu (CAS № 137-40-6, kimyəvi formul C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) ilıq MilliQ suda 1 M konsentrasiyaya qədər həll edin və 4 °C-də saxlayın. Müalicə günündə bu məhlulu 1 M PPA ilə 3 mM və 5 mM PPA-ya qədər serumsuz mühitdə (L-qlütaminli DMEM/F-12) durulaşdırın. Bütün təcrübələr üçün müalicə konsentrasiyaları PPA (0 mM, nəzarət), 3 mM və 5 mM PPA olmamışdır. Təcrübələr ən azı üç bioloji təkrarda aparılmışdır.
SH-SY5Y hüceyrələri 25 sm5 ölçülü kolbalara 5,5 × 105 hüceyrə/ml sürətlə əkilmiş və 24 saat ərzində yetişdirilmişdir. PPA müalicəsi 24 saat inkubasiyadan əvvəl kolbaya əlavə edilmişdir. Normal məməli toxuma subkultura protokollarına (yuxarıda təsvir edilmişdir) uyğun olaraq hüceyrə qranullarını toplayın. Hüceyrə qranulunu 100 µl 2,5% qlutaraldehid, 1× PBS-də yenidən əridin və emal olunana qədər 4°C-də saxlayın. SH-SY5Y hüceyrələri hüceyrələri əritmək və 2,5% qlutaraldehid, 1× PBS məhlulunu çıxarmaq üçün qısa müddətə santrifüj edilmişdir. Çöküntünü distillə edilmiş suda hazırlanmış 4% aqaroza gelində yenidən əridin (aqarozanın çöküntü həcminə nisbəti 1:1-dir). Aqaroza parçaları düz lövhələr üzərində torlara yerləşdirilmiş və yüksək təzyiqli dondurmadan əvvəl 1-heksadesenlə örtülmüşdür. Nümunələr -90°C-də 24 saat ərzində 100% quru asetonda dondurulmuşdur. Daha sonra temperatur -80°C-yə qaldırıldı və 1% osmium tetroksid və 0,1% qlutaraldehid məhlulu əlavə edildi. Nümunələr -80°C-də 24 saat saxlanıldı. Bundan sonra, temperatur bir neçə gün ərzində tədricən otaq temperaturuna qədər artırıldı: 24 saat ərzində -80 °C-dən -50 °C-yə, 24 saat ərzində -30 °C-yə, 24 saat ərzində -10 °C-yə və nəhayət otaq temperaturuna qədər.
Kriogen hazırlıqdan sonra nümunələr qətranla hopdurulmuş və Leica Reichert UltracutS ultramikrotomundan (Leica Microsystems) istifadə edərək ultra nazik kəsiklər (təxminən 100 nm) hazırlanmışdır. Kəsiklər 2% uranil asetat və qurğuşun sitratla boyanmışdır. Nümunələr 200 kV-da işləyən FEI Tecnai 20 ötürücü elektron mikroskopu (ThermoFisher (əvvəllər FEI), Eindhoven, Hollandiya) (Lab6 ötürücü) və Tridiem enerji filtri ilə təchiz olunmuş Gatan CCD kamerası (Gatan, Böyük Britaniya) istifadə edilərək müşahidə edilmişdir.
Hər texniki təkrarlamada ən azı 24 tək hüceyrəli şəkil əldə edildi, ümumilikdə 266 şəkil. Bütün şəkillər Maraq Bölgəsi (ROI) makrosu və Mitoxondria makrosu istifadə edilərək təhlil edildi. Mitoxondrial makro dərc olunmuş metodlara17,31,32 əsaslanır və Fiji/ImageJ69-da TEM şəkillərinin yarıavtomatlaşdırılmış toplu emalına imkan verir. Xülasə: şəkil yuvarlanan top fon çıxarma (60 piksel radius) və FFT bant ötürücü filtri (müvafiq olaraq 60 və 8 piksel yuxarı və aşağı sərhədlərdən istifadə etməklə) və 5% oriyentasiya tolerantlığı ilə şaquli xətt basqısı istifadə edilərək tərsinə çevrilir və tərsinə çevrilir. İşlənmiş şəkil maksimum entropiya alqoritmi istifadə edilərək avtomatik olaraq eşiklənir və ikili maska ​​yaradılır. Xam TEM şəkillərində əl ilə seçilmiş ROI-lərlə əlaqəli şəkil bölgələri çıxarılaraq mitoxondriləri xarakterizə edir və plazma membranını və digər yüksək kontrastlı bölgələri xaric edir. Hər bir çıxarılan ROI üçün 600 pikseldən böyük ikili hissəciklər təhlil edildi və hissəcik sahəsi, perimetri, böyük və kiçik oxlar, Feret diametri, yuvarlaqlığı və dairəviliyi Fiji/ImageJ-nin daxili ölçmə funksiyalarından istifadə edilərək ölçüldü. Merrill, Flippo və Strack (2017)-dən sonra, sahə 2, hissəcik aspekt nisbəti (böyük-kiçik ox nisbəti) və forma faktoru (FF) bu məlumatlardan hesablandı, burada FF = perimetr 2/4pi x sahə. Parametrik düsturun tərifini Merrill, Flippo və Strack (2017)-də tapa bilərsiniz. Qeyd olunan makrolar GitHub-da mövcuddur (Məlumatların Mövcudluğu Bəyannaməsinə baxın). Orta hesabla, hər PPA müalicəsində təxminən 5600 hissəcik təhlil edildi, ümumilikdə təxminən 17000 hissəcik (məlumatlar göstərilməyib).
SH-SH5Y hüceyrələri bir gecə ərzində yapışmaya imkan vermək üçün 8 kameralı becərmə qablarına (ThermoFisher, #155411) yerləşdirildi və sonra TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) və Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) ilə inkubasiya edildi. Boyama. Şəkillər 10 dəqiqəlik mühitdə 405 nm və 561 nm lazerlərdən istifadə edilərək əldə edildi və xam şəkillər 12 sonrakı zaman nöqtəsində şəkil çərçivələri arasında 0,2 μm az addımı ilə 10 şəkil mikroqrafı olan z-yığınlar şəklində əldə edildi. Şəkillər LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 linzasından istifadə edərək Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 super qətnamə platformasından (Carl Zeiss, Oberkochen, Almaniya) istifadə edilərək toplandı. Şəkillər, birləşmə və parçalanma hadisələrini, mitoxondrial strukturların orta sayını və hüceyrə başına orta mitoxondrial həcmi ölçmək üçün əvvəllər təsvir edilmiş boru kəməri və ImageJ plagini istifadə edərək ImageJ-də təhlil edilmişdir33. MEL makroları GitHub-da mövcuddur (Məlumatların Mövcudluğu Bəyannaməsinə baxın).
SH-SY5Y hüceyrələri müalicədən əvvəl 24 saat ərzində altı quyulu lövhələrdə 0,3 × 106 hüceyrə/ml sıxlığında yetişdirildi. RNT, kiçik dəyişikliklərlə Quick-RNA™ Miniprep protokolu (ZR R1055, Zymo Research) istifadə edilərək çıxarıldı: çıxarılmadan əvvəl hər quyuya 300 μl RNT lizis buferi əlavə edin və hər nümunəni son addım olaraq 30 μl DNase/RNase elusiyası ilə lizis edin. -sız su. Bütün nümunələr NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spektrofotometri istifadə edilərək kəmiyyət və keyfiyyət baxımından yoxlanıldı. Hüceyrə lizatlarından alınan ümumi protein 200 μl RIPA lizis buferi istifadə edilərək əldə edildi və protein konsentrasiyası Bradford protein analizi istifadə edilərək ölçüldü70.
kDNK sintezi, istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq, bəzi dəyişikliklərlə Tetro™ kDNK Sintez Dəsti (BIO-65043, Meridian Bioscience) istifadə edilərək həyata keçirilmişdir. kDNK, 0,7-1 μg ümumi RNT istifadə edilərək 20 μl reaksiyalarda sintez edilmişdir. Primerlər əvvəllər dərc olunmuş 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Cədvəl S1) məqalələrindən seçilmişdir və müşayiət olunan zondlar Integrated DNA Technologies şirkətinin PrimerQuest alətindən istifadə edilərək hazırlanmışdır. Maraq doğuran bütün genlər nüvə B2M geninə normallaşdırılmışdır. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC və OPA1 genlərinin ifadəsi RT-qPCR ilə ölçülmüşdür. Əsas qarışıq hər reaksiya üçün 10 μL son həcm əldə etmək üçün LUNA Taq polimeraza (M3003L, New England Biolabs), 10 μM irəli və tərs praymerlər, kDNT və PCR dərəcəli sudan ibarət idi. Bölünmə və bölünmə genlərinin ifadəsi (DRP1, MFN1/2) TaqMan multipleks analizləri istifadə edilərək ölçüldü. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq kiçik dəyişikliklərlə istifadə edildi. Multipleks RT-qPCR əsas qarışığına 1X LUNA Taq polimeraza, 10 μM irəli və tərs praymerlər, 10 μM zond, kDNT və PCR dərəcəli su daxildir və nəticədə hər reaksiya üçün 20 μL son həcm əldə edilir. RT-qPCR Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—seriya nömrəsi: R0618110) istifadə edilərək həyata keçirildi. Dövr şərtləri Cədvəl S1-də göstərilib. Bütün kDNT nümunələri üçqat şəkildə gücləndirilmiş və onqat durulaşdırma seriyasından istifadə edərək standart əyri yaradılmışdır. Dövr həddi standart sapması (Ct) >0.5 olan üçqat nümunələrdə kənar göstəricilər məlumatların təkrarlanmasını təmin etmək üçün təhlildən çıxarılmışdır30,72. Nisbi gen ifadəsi 2-ΔΔCt79 metodu ilə hesablanmışdır.
Zülal nümunələri (60 μg) Laemmli yükləmə buferi ilə 2:1 nisbətində qarışdırıldı və 12% rəngsiz protein geli (Bio-Rad #1610184) üzərində işlədildi. Zülallar Trans-Blot Turbo sistemi (#170-4155, Bio-Rad) istifadə edərək PVDF (poliviniliden florid) membranına (#170-84156, Bio-Rad) köçürüldü. Membran bloklandı və müvafiq ilkin antikorlar (OPA1, MFN1, MFN2 və DRP1) ilə 48 saat ərzində inkubasiya edildi (1:1000 nisbətində seyreltildi), ardınca 1 saat ərzində ikincili antikorlar (1:10,000) ilə inkubasiya edildi. Daha sonra membranlar Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) istifadə edərək görüntüləndi və Bio-Rad ChemiDoc MP sistemi istifadə edərək qeyd edildi. Western blot analizi üçün ImageLab versiyası 6.1 istifadə edildi. Orijinal gel və ləkə Şəkil S1-də göstərilib. Antikor haqqında məlumat Cədvəl S2-də verilmişdir.
Məlumat dəstləri ən azı üç müstəqil nümunənin orta qiyməti və standart xətası (SEM) kimi təqdim olunur. Məlumat dəstləri Qaus paylanmasını və bərabər standart sapmaları fərz etməzdən və təhlillərə davam etməzdən əvvəl Şapiro-Uilks testindən istifadə edərək normallıq üçün sınaqdan keçirilmişdir (başqa cür göstərilməyibsə). Məlumat dəstini təhlil etməklə yanaşı, əhəmiyyəti müəyyən etmək üçün Fişerin MEL LSD (p < 0.05), birtərəfli ANOVA (müalicə və nəzarət ortalaması) və Dunnettin çoxsaylı müqayisə testindən istifadə edilmişdir (p < 0.05). Əhəmiyyətli p dəyərləri qrafikdə *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 kimi göstərilir. Bütün statistik təhlillər və qrafiklər GraphPad Prism 9.4.0 istifadə edilərək aparılmış və yaradılmışdır.
TEM görüntü analizi üçün Fiji/ImageJ makroları GitHub-da açıq şəkildə mövcuddur: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitoxondrial Hadisə Lokatoru (MEL) makrosu GitHub-da açıq şəkildə mövcuddur: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM və Vijaya A. Mitoxondriyalar: maddələr mübadiləsinin, homeostazın, stressin, yaşlanmanın və epigenetikanın əsas tənzimləyiciləri. İndoneziya. Biotibbi Elm. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Şizofreniya, I kompleksində mümkün patoloji hədəf kimi çoxşaxəli mitoxondrial disfunksiya. Şizofreniya. resurs. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. və Beal, MF Parkinson xəstəliyində mitoxondrial disfunksiya. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Şarma VK, Sinq TG və Mehta V. Stressli mitoxondriyalar: Alzheimer xəstəliyində invaziya hədəfləri. Mitoxondrilər 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF və Ferreira GK Mitoxondriya və beyin: bioenerji və daha çox. Neyrotoksinlər. resurs. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. və b. Pleiotrop mitoxondriyalar: mitoxondriyanın neyron inkişafına və xəstəliklərinə təsiri. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardano-Ramos, C. və Morais, VA Neyronlarda mitoxondrial biogenez: necə və harada. beynəlxalqlik. J. Mohr. elm. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. və Zhao, J. Məməlilərin mitoxondrial dinamikasının tənzimlənməsi: imkanlar və çətinliklər. ön. endokrin. (Lozanna) 11, 374 (2020).
Khacho, M. və Slack, RS Neyrogenezin tənzimlənməsində mitoxondrial dinamika: inkişafdan yetkin beyinə qədər. inkişaf. dinamik. 247, 47–53 (2018).