Məqalə "Paxlalıların patogenlərə və zərərvericilərə qarşı müqavimətinin artırılması" tədqiqat mövzusunun bir hissəsidir, bütün 5 məqaləyə baxın
Göbələk bitki xəstəliyi nekrozunun səbəbkar agenti olan Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, müxtəlif ev sahibi bitkiləri yoluxdurmaq üçün çoxpilləli bir strategiyadan istifadə edir. Bu tədqiqat, Pseudomonas sclerotiorum tərəfindən törədilən ağ kifə qarşı Phaseolus vulgaris L.-nin molekulyar, fizioloji və biokimyəvi reaksiyalarını artırmaq üçün alternativ bir idarəetmə strategiyası olaraq digər vacib amin turşularının sintezini stimullaşdıran zülal olmayan amin turşusu olan diamin L-ornitinin istifadəsini təklif edir. In vitro təcrübələr göstərdi ki, L-ornitin S. pyrenoidosa-nın miselyal böyüməsini dozadan asılı olaraq əhəmiyyətli dərəcədə inhibə edir. Bundan əlavə, istixana şəraitində ağ kifin şiddətini əhəmiyyətli dərəcədə azalda bilər. Bundan əlavə, L-ornitin müalicə olunmuş bitkilərin böyüməsini stimullaşdırdı və bu da sınaqdan keçirilmiş L-ornitinin konsentrasiyalarının müalicə olunmuş bitkilər üçün fitotoksik olmadığını göstərir. Bundan əlavə, L-ornitin qeyri-fermentativ antioksidantların (ümumi həll olan fenollar və flavonoidlər) və fermentativ antioksidantların (katalaza (CAT), peroksidaza (POX) və polifenol oksidaza (PPO)) ifadəsini artırmış və antioksidantla əlaqəli üç genin (PvCAT1, PvSOD və PvGR) ifadəsini artırmışdır. Bundan əlavə, silika analizində S. sclerotiorum genomunda ehtimal olunan oksaloasetat asetilhidrolaza (SsOAH) zülalının mövcudluğu aşkar edilmişdir ki, bu da funksional analiz, qorunan domenlər və topologiya baxımından Aspergillus fijiensis (AfOAH) və Penicillium sp. (PlOAH) oksaloasetat asetilhidrolaza (SsOAH) zülallarına çox oxşardır. Maraqlıdır ki, L-ornitinin kartof dekstroza bulyonu (PDB) mühitinə əlavə edilməsi S. sclerotiorum miseliyasında SsOAH geninin ifadəsini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır. Eynilə, L-ornitinin ekzogen tətbiqi müalicə olunmuş bitkilərdən toplanan göbələk miseliyalarında SsOAH geninin ifadəsini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır. Nəhayət, L-ornitinin tətbiqi həm PDB mühitində, həm də yoluxmuş yarpaqlarda oksalik turşu ifrazını əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır. Nəticə olaraq, L-ornitin redoks statusunun qorunmasında, eləcə də yoluxmuş bitkilərin müdafiə reaksiyasının gücləndirilməsində əsas rol oynayır. Bu tədqiqatın nəticələri ağ kifi idarə etmək və onun paxla istehsalına və digər bitkilərə təsirini azaltmaq üçün innovativ, ekoloji cəhətdən təmiz metodların hazırlanmasına kömək edə bilər.
Nekrotrofik göbələk Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary tərəfindən törədilən ağ kif, qlobal lobya (Phaseolus vulgaris L.) istehsalına ciddi təhlükə yaradan dağıdıcı, məhsuldarlığı azaldan bir xəstəlikdir (Bolton və b., 2006). Sclerotinia sclerotiorum, 600-dən çox bitki növünün geniş çeşidinə və qeyri-spesifik bir şəkildə ev toxumalarını sürətlə maserasiya etmək qabiliyyətinə malik olan, nəzarət etmək üçün ən çətin torpaqda yayılan göbələk bitki patogenlərindən biridir (Liang və Rollins, 2018). Əlverişsiz şəraitdə, o, həyat dövrünün kritik bir mərhələsindən keçir, torpaqda "sklerotiya" adlanan qara, sərt, toxum kimi strukturlar və ya yoluxmuş bitkilərin miselyumunda və ya gövdə dibində ağ, tüklü böyümələr şəklində uzun müddət yuxuda qalır (Schwartz və b., 2005). S. sclerotiorum sklerotiya əmələ gətirməyə qadirdir ki, bu da onun yoluxmuş tarlalarda uzun müddət yaşamasına və xəstəlik zamanı davam etməsinə imkan verir (Schwartz və b., 2005). Sklerotiyalar qida maddələri ilə zəngindir, torpaqda uzun müddət qala bilər və sonrakı infeksiyalar üçün əsas inokulum kimi xidmət edir (Schwartz və b., 2005). Əlverişli şəraitdə sklerotiyalar cücərir və hava ilə yayılan sporlar əmələ gətirir ki, bu da bitkinin bütün yerüstü hissələrini, o cümlədən çiçəkləri, gövdələrini və ya paxlaları yoluxdura bilər (Schwartz və b., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum, sklerotial cücərmədən simptomların inkişafına qədər bir sıra əlaqəli hadisələri əhatə edən ev sahibi bitkilərini yoluxdurmaq üçün çoxmərhələli bir strategiyadan istifadə edir. Əvvəlcə S. sclerotiorum, apotesiya adlanan göbələyəbənzər strukturlardan asılı sporlar (askosporlar adlanır) istehsal edir ki, bunlar havada olur və yoluxmuş bitki qalıqlarında hərəkətsiz sklerotiyalara çevrilir (Bolton və b., 2006). Daha sonra göbələk bitki hüceyrə divarının pH-nı idarə etmək, fermentativ parçalanmanı və toxuma invaziyasını təşviq etmək (Hegedus və Rimmer, 2005) və ev sahibi bitkinin oksidləşdirici partlayışını yatırmaq üçün virulentlik faktoru olan oksalik turşusu ifraz edir. Bu turşulaşma prosesi bitki hüceyrə divarını zəiflədir, göbələk hüceyrə divarını parçalayan fermentlərin (CWDE) normal və səmərəli işləməsi üçün əlverişli bir mühit yaradır və patogenin fiziki maneəni aşmasına və ev sahibi toxumalarına nüfuz etməsinə imkan verir (Marciano və b., 1983). S. sclerotiorum nüfuz etdikdən sonra, yoluxmuş toxumalarda yayılmasını asanlaşdıran və toxuma nekrozuna səbəb olan poliqalakturonaza və sellülaza kimi bir sıra CWDE ifraz edir. Lezyonların və hifalı örtüklərin irəliləməsi ağ kifin xarakterik simptomlarına gətirib çıxarır (Hegedus və Rimmer, 2005). Bu vaxt, ev sahibi bitkilər patogenlə əlaqəli molekulyar nümunələri (PAMP) nümunə tanıma reseptorları (PRR) vasitəsilə tanıyır və nəticədə müdafiə reaksiyalarını aktivləşdirən bir sıra siqnal hadisələrini tetikler.
Onilliklər ərzində xəstəliklərə nəzarət səylərinə baxmayaraq, digər kommersiya bitkilərində olduğu kimi, paxlada da patogenin müqaviməti, sağ qalması və uyğunlaşma qabiliyyəti səbəbindən kifayət qədər davamlı rüşeym plazmasının çatışmazlığı qalmaqdadır. Buna görə də xəstəliklərin idarə olunması olduqca çətindir və mədəni təcrübələrin, bioloji nəzarətin və kimyəvi funqisidlərin kombinasiyasını əhatə edən inteqrasiya olunmuş, çoxşaxəli strategiya tələb edir (O'Sullivan və b., 2021). Ağ kifin kimyəvi nəzarəti ən təsirli üsuldur, çünki düzgün və vaxtında tətbiq edildikdə funqisidlər xəstəliyin yayılmasını effektiv şəkildə idarə edə, infeksiyanın şiddətini azalda və məhsul itkisini minimuma endirə bilər. Bununla belə, funqisidlərdən həddindən artıq istifadə və onlara həddindən artıq etibar etmək S. sclerotiorum-un davamlı ştammlarının yaranmasına səbəb ola bilər və hədəf olmayan orqanizmlərə, torpaq sağlamlığına və suyun keyfiyyətinə mənfi təsir göstərə bilər (Le Cointe və b., 2016; Ceresini və b., 2024). Buna görə də, ekoloji cəhətdən təmiz alternativlərin tapılması əsas prioritetə ​​çevrilib.
Putresin, spermidin, spermin və kadaverin kimi poliaminlər (PA) torpaqda yayılan bitki patogenlərinə qarşı perspektivli alternativlər kimi xidmət edə bilər və bununla da təhlükəli kimyəvi funqisidlərin istifadəsini tamamilə və ya qismən azaldır (Nehela və b., 2024; Yi və b., 2024). Ali bitkilərdə PA-lar hüceyrə bölünməsi, differensiasiyası və abiotik və biotik stresslərə qarşı reaksiya daxil olmaqla, lakin bunlarla məhdudlaşmayaraq bir çox fizioloji proseslərdə iştirak edir (Killiny və Nehela, 2020). Onlar antioksidant kimi çıxış edə, reaktiv oksigen növlərini (ROS) təmizləməyə kömək edə, redoks homeostazını qoruya bilər (Nehela və Killiny, 2023), müdafiə ilə əlaqəli genləri stimullaşdıra bilər (Romero və b., 2018), müxtəlif metabolik yolları tənzimləyə bilər (Nehela və Killiny, 2023), endogen fitohormonları modulyasiya edə bilər (Nehela və Killiny, 2019), sistemik qazanılmış müqavimət (SAR) yarada və bitki-patogen qarşılıqlı təsirlərini tənzimləyə bilər (Nehela və Killiny, 2020; Asija və b., 2022; Czerwoniec, 2022). Qeyd etmək lazımdır ki, bitki müdafiəsində PA-ların spesifik mexanizmləri və rolları bitki növlərindən, patogenlərdən və ətraf mühit şəraitindən asılı olaraq dəyişir. Bitkilərdə ən çox yayılmış PA əsas poliamin L-ornitindən biosintez olunur (Killiny və Nehela, 2020).
L-ornitin bitkilərin böyüməsində və inkişafında çoxsaylı rol oynayır. Məsələn, əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, düyüdə (Oryza sativa) ornitin azotun təkrar emalı (Liu və b., 2018), düyü məhsuldarlığı, keyfiyyəti və aroması (Lu və b., 2020) və su stresinə reaksiya (Yang və b., 2000) ilə əlaqəli ola bilər. Bundan əlavə, L-ornitinin ekzogen tətbiqi şəkər çuğundurunda (Beta vulgaris) quraqlığa dözümlülüyü əhəmiyyətli dərəcədə artırmışdır (Hussein və b., 2019) və soğanda (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu və Çavuşoǧlu, 2021) və kajuda (Anacardium occidentale) duz stresini azaltmışdır (da Rocha və b., 2012). L-ornitinin abiotik stresdən qorunmadakı potensial rolu, müalicə olunmuş bitkilərdə prolin yığılmasında iştirakı ilə əlaqəli ola bilər. Məsələn, ornitin delta aminotransferaza (delta-OAT) və prolin dehidrogenaza (ProDH1 və ProDH2) genləri kimi prolin metabolizması ilə əlaqəli genlərin əvvəllər Nicotiana benthamiana və Arabidopsis thaliana-nın sahib olmayan Pseudomonas syringae ştammlarına qarşı qorunmasında iştirak etdiyi bildirilmişdir (Senthil-Kumar və Mysore, 2012). Digər tərəfdən, patogenin böyüməsi üçün göbələk ornitin dekarboksilazası (ODC) tələb olunur (Singh və b., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici-nin ODC-sini sahib tərəfindən induksiya edilmiş gen susdurulması (HIGS) vasitəsilə hədəf almaq pomidor bitkilərinin Fusarium solmasına qarşı müqavimətini əhəmiyyətli dərəcədə artırmışdır (Singh və b., 2020). Lakin, ekzogen ornitinin fitopatogenlər kimi biotik stresslərə qarşı tətbiqinin potensial rolu yaxşı öyrənilməmişdir. Daha da əhəmiyyətlisi, ornitinin xəstəliklərə qarşı müqavimətə və əlaqəli biokimyəvi və fizioloji hadisələrə təsiri hələ də geniş şəkildə araşdırılmamışdır.
Paxlalıların S. sclerotiorum infeksiyasının mürəkkəbliyini anlamaq effektiv nəzarət strategiyalarının hazırlanması üçün vacibdir. Bu tədqiqatda, paxlalı bitkilərin müdafiə mexanizmlərini və Sclerotinia sclerotiorum infeksiyasına qarşı müqavimətini artırmaqda əsas amil kimi diamin L-ornitinin potensial rolunu müəyyən etməyi hədəflədik. Yoluxmuş bitkilərin müdafiə reaksiyalarını artırmaqla yanaşı, L-ornitinin redoks statusunun qorunmasında da əsas rol oynadığını fərz edirik. L-ornitinin potensial təsirlərinin fermentativ və qeyri-fermentativ antioksidan müdafiə mexanizmlərinin tənzimlənməsi və göbələk patogenliyi/virulentlik amillərinə və əlaqəli zülallara müdaxilə ilə əlaqəli olduğunu irəli sürürük. L-ornitinin bu ikili funksionallığı onu ağ kifin təsirini azaltmaq və adi paxlalı bitkilərin bu güclü göbələk patogeninə qarşı müqavimətini artırmaq üçün davamlı bir strategiya üçün perspektivli bir namizədə çevirir. Bu tədqiqatın nəticələri ağ kifi idarə etmək və onun paxlalı istehsalına təsirini azaltmaq üçün innovativ, ekoloji cəhətdən təmiz metodların hazırlanmasına kömək edə bilər.
Bu tədqiqatda, təcrübə materialı kimi həssas kommersiya tipli adi paxla növü olan Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) istifadə edilmişdir. Sağlam toxumlar Misir Kənd Təsərrüfatı Tədqiqat Mərkəzinin (ARC) Tarla Bitkiləri Tədqiqat İnstitutunun (FCRI) Paxlalı Bitkilər Tədqiqatları Departamenti tərəfindən təmin edilmişdir. İstixana şəraitində (25 ± 2 °C, nisbi rütubət 75 ± 1%, 8 saat işıqlı/16 saat qaranlıq) S. sclerotiorum ilə yoluxmuş torpaqla doldurulmuş plastik qablara (daxili diametri 35 sm, dərinliyi 50 sm) beş toxum əkilmişdir. Əkindən 7-10 gün sonra (DPS), hər qabda yalnız vahid böyüməyə malik iki fidan və üç tam genişlənmiş yarpaq qalması üçün fidanlar seyreltilmişdir. Bütün qab bitkiləri hər iki həftədə bir dəfə suvarılmış və verilən növ üçün tövsiyə olunan nisbətdə aylıq gübrələnmişdir.
500 mq/L konsentrasiyalı L-ornitindiamin (həmçinin (+)-(S)-2,5-diaminopentanoik turşusu kimi də tanınır; Sigma-Aldrich, Darmştadt, Almaniya) hazırlamaq üçün 50 mq əvvəlcə 100 ml steril distillə edilmiş suda həll edildi. Daha sonra hazır məhlul durulaşdırıldı və sonrakı təcrübələrdə istifadə edildi. Qısaca desək, altı seriyalı L-ornitin konsentrasiyası (12,5, 25, 50, 75, 100 və 125 mq/L) in vitro sınaqdan keçirildi. Bundan əlavə, steril distillə edilmiş su mənfi nəzarət (Mock) kimi istifadə edildi və kommersiya funqisidi olan “Rizolex-T” 50% islanan toz (toklofos-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Valiliyi, Misir) müsbət nəzarət kimi istifadə edildi. Kommersiya məqsədli funqisid “Rizolex-T” in vitro şəraitində beş konsentrasiyada (2, 4, 6, 8 və 10 mq/L) sınaqdan keçirilmişdir.
Ağ kifin tipik simptomlarını göstərən (infeksion nisbəti: 10-30%) adi paxla gövdələri və paxlalarının nümunələri kommersiya təsərrüfatlarından toplanmışdır. Yoluxmuş bitki materiallarının əksəriyyəti növ/çeşid (həssas kommersiya növü Giza 3) ilə müəyyən edilsə də, digərləri, xüsusən də yerli bazarlardan əldə edilənlər naməlum növlərə aid idi. Toplanan yoluxmuş materiallar əvvəlcə 0,5% natrium hipoxlorit məhlulu ilə 3 dəqiqə səthi dezinfeksiya edilmiş, sonra bir neçə dəfə steril distillə edilmiş su ilə yuyulmuş və artıq suyu təmizləmək üçün steril filtr kağızı ilə qurudulmuşdur. Yoluxmuş orqanlar daha sonra orta toxumadan (sağlam və yoluxmuş toxumalar arasında) kiçik parçalara kəsilmiş, kartof dekstroza aqar (PDA) mühitində becərilən və sklerotiya əmələ gəlməsini stimullaşdırmaq üçün 25 ± 2 °C-də 12 saat işıq/12 saat qaranlıq dövr ilə 5 gün inkubasiya edilmişdir. Miselium ucluq metodu həmçinin qarışıq və ya çirklənmiş mədəniyyətlərdən göbələk izolatlarını təmizləmək üçün də istifadə edilmişdir. Təmizlənmiş göbələk izolyatı əvvəlcə mədəni morfoloji xüsusiyyətlərinə əsasən müəyyən edilmiş və sonra mikroskopik xüsusiyyətlərə əsasən S. sclerotiorum olduğu təsdiqlənmişdir. Nəhayət, bütün təmizlənmiş izolatlar Koch postulatlarına cavab vermək üçün həssas adi lobya kultivarı Giza 3 üzərində patogenlik baxımından sınaqdan keçirilmişdir.
Bundan əlavə, ən invaziv S. sclerotiorum izolyatı (izolat #3), White və digərləri, 1990; Baturo-Ciesniewska və digərləri, 2017 tərəfindən təsvir edildiyi kimi, daxili transkripsiya olunmuş spacer (ITS) ardıcıllığına əsasən daha da təsdiqləndi. Qısaca desək, izolatlar kartof dekstroza bulyonunda (PDB) becərildi və 25 ± 2 °C-də 5-7 gün ərzində inkubasiya edildi. Daha sonra göbələk miselyumu toplandı, pendirdən süzüldü, iki dəfə steril su ilə yuyuldu və steril filtr kağızı ilə quruduldu. Genom DNT-si Quick-DNA™ Göbələk/Bakterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah və digərləri, 2022, 2024) istifadə edilərək təcrid edildi. Daha sonra ITS rDNA bölgəsi spesifik praymer cütü ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATGC; gözlənilən ölçü: 540 bp) istifadə edilərək gücləndirildi (Baturo-Ciesniewska və b., 2017). Təmizlənmiş PCR məhsulları ardıcıllıqla yoxlanılmaq üçün təqdim edildi (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA ardıcıllıqları Sanger ardıcıllıqla yoxlanılma metodundan istifadə edərək iki istiqamətli ardıcıllıqla yoxlanıldı. Yığılmış sorğu ardıcıllıqları daha sonra BLASTn proqram təminatından istifadə edərək GenBank və Milli Biotexnologiya Məlumat Mərkəzindəki (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ən son məlumatlarla müqayisə edildi. Sorğu ardıcıllığı, Molekulyar Təkamül Genetika Analiz Paketindəki (MEGA-11; versiya 11) ClustalW istifadə edərək NCBI GenBank-dakı ən son məlumatlardan (Əlavə Cədvəl S1) əldə edilmiş 20 digər S. sclerotiorum ştammı/izolyatı ilə müqayisə edildi (Kumar və b., 2024). Təkamül təhlili maksimum ehtimal metodu və ümumi zamanla geri dönən nukleotid əvəzetmə modeli (Nei və Kumar, 2000) istifadə edilərək aparıldı. Ən yüksək loqarifmik ehtimala malik ağac göstərilir. Evristik axtarış üçün ilkin ağac, qonşu qoşulan (NJ) ağacı (Kumar və b., 2024) və maksimum parsimoniya (MP) ağacı arasında daha yüksək loqarifmik ehtimala malik ağac seçilməklə seçilir. NJ ağacı ümumi zamanla geri dönən model (Nei və Kumar, 2000) istifadə edilərək hesablanmış cüt məsafə matrisindən istifadə edilərək qurulmuşdur.
L-ornitinin və “Rizolex-T” bakterisidinin antibakterial aktivliyi in vitro şəraitində agar diffuziya metodu ilə təyin edilmişdir. Metod: L-ornitinin ehtiyat məhlulundan (500 mq/L) müvafiq miqdarda götürün və müvafiq olaraq 12,5, 25, 50, 75, 100 və 125 mq/L son konsentrasiyaları olan məhlullar hazırlamaq üçün 10 ml PDA qida mühiti ilə yaxşıca qarışdırın. Nəzarət kimi beş konsentrasiyalı funqisid “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 və 10 mq/L) və steril distillə edilmiş su istifadə edilmişdir. Mühit bərkidikdən sonra, diametri 4 mm olan yeni hazırlanmış Sclerotinia sclerotiorum kulturasının miselial tıxacı Petri qabının mərkəzinə köçürülmüş və miselyum bütün nəzarət Petri qabını əhatə edənə qədər 25±2°C-də becərilmişdir, bundan sonra göbələk böyüməsi qeydə alınmışdır. 1-ci tənlikdən istifadə edərək S. sclerotiorum-un radial böyüməsinin faiz inhibisiyasını hesablayın:
Təcrübə iki dəfə təkrarlandı, hər bir nəzarət/təcrübə qrupu üçün altı bioloji replika və hər bir bioloji replika üçün beş qab (hər qabda iki bitki) istifadə edildi. Təcrübə nəticələrinin dəqiqliyini, etibarlılığını və təkrarlanmasını təmin etmək üçün hər bir bioloji replika iki dəfə (iki texniki replika) təhlil edildi. Bundan əlavə, yarımmaksimal inhibitor konsentrasiyasını (IC50) və IC99-u hesablamaq üçün probit reqressiya analizindən istifadə edildi (Prentice, 1976).
İstixana şəraitində L-ornitinin potensialını qiymətləndirmək üçün ardıcıl iki qab təcrübəsi aparıldı. Qısaca olaraq, qablar sterilizasiya edilmiş gil-qum torpağı (3:1) ilə dolduruldu və yeni hazırlanmış S. sclerotiorum kulturası ilə peyvənd edildi. Əvvəlcə, S. sclerotiorum-un ən invaziv izolyatı (izolyat #3) bir sklerotiumun yarıya bölünməsi, üzü aşağı PDA-nın üzərinə qoyulması və miselyumun böyüməsini stimullaşdırmaq üçün 25°C-də 4 gün ərzində daimi qaranlıqda (24 saat) inkubasiya edilməsi ilə becərildi. Daha sonra ön kənarından dörd 5 mm diametrli aqar tıxacı götürüldü və 100 q steril buğda və düyü kəpəyi qarışığı (1:1, v/v) ilə peyvənd edildi və bütün kolbalar sklerotiyanın əmələ gəlməsini stimullaşdırmaq üçün 25 ± 2°C-də 5 gün ərzində 12 saat işıq/12 saat qaranlıq dövrədə inkubasiya edildi. Torpaq əlavə etməzdən əvvəl homojenliyi təmin etmək üçün bütün kolbaların tərkibi yaxşıca qarışdırıldı. Daha sonra, patogenlərin sabit konsentrasiyasını təmin etmək üçün hər qaba 100 q kolonizasiya edən kəpək qarışığı əlavə edildi. Peyvənd edilmiş qablar göbələklərin böyüməsini aktivləşdirmək üçün suvarıldı və 7 gün istixana şəraitində yerləşdirildi.
Daha sonra hər qaba Giza 3 növünün beş toxumu səpildi. L-ornitin və Rizolex-T funqisidi ilə müalicə olunmuş qablar üçün sterilizasiya olunmuş toxumlar əvvəlcə iki birləşmənin sulu məhlulunda iki saat isladıldı və son IC99 konsentrasiyası müvafiq olaraq təxminən 250 mq/L və 50 mq/L oldu və sonra əkin etməzdən əvvəl bir saat havada quruduldu. Digər tərəfdən, toxumlar mənfi nəzarət olaraq steril distillə edilmiş suda isladıldı. 10 gündən sonra, ilk suvarmadan əvvəl, fidanlar seyreltildi və hər qabda yalnız iki səliqəli fidan qaldı. Bundan əlavə, S. sclerotiorum ilə yoluxmanın qarşısını almaq üçün eyni inkişaf mərhələsindəki (10 gün) paxla bitkisinin gövdələri sterilizasiya olunmuş skalpel istifadə edərək iki fərqli yerdə kəsildi və hər yaraya təxminən 0,5 q kolonizasiya kəpəyi qarışığı yerləşdirildi, ardınca bütün peyvənd olunmuş bitkilərdə infeksiyanı və xəstəliyin inkişafını stimullaşdırmaq üçün yüksək rütubət tətbiq edildi. Nəzarət bitkiləri də oxşar şəkildə yaralandı və xəstəliyin inkişafı üçün mühiti simulyasiya etmək və müalicə qrupları arasında uyğunluğu təmin etmək məqsədilə yaraya bərabər miqdarda (0,5 q) steril, kolonizasiya olunmamış kəpək qarışığı yerləşdirildi və yüksək rütubət altında saxlanıldı.
Müalicə üsulu: Paxla fidanları torpağı suvarmaqla 500 ml L-ornitin (250 mq/l) sulu məhlulu və ya Rizolex-T funqisidi (50 mq/l) ilə suvarıldı, sonra müalicə 10 günlük fasilələrlə üç dəfə təkrarlandı. Plasebo ilə müalicə olunmuş nəzarət növləri 500 ml steril distillə edilmiş su ilə suvarıldı. Bütün müalicələr istixana şəraitində (25 ± 2°C, 75 ± 1% nisbi rütubət və 8 saat işıqlı/16 saat qaranlıq fotoperiodu) aparıldı. Bütün qablar iki həftədən bir suvarıldı və aylıq olaraq konkret növ üçün tövsiyələrə və istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq 3-4 q/l konsentrasiyasında yarpaq çiləmə üsulu ilə balanslaşdırılmış NPK gübrəsi (20-20-20, 3,6% kükürd və TE mikroelementləri ilə; Zain Seeds, Misir) ilə müalicə edildi. Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, tam genişlənmiş yetkin yarpaqlar (yuxarıdan 2-ci və 3-cü yarpaqlar) hər bioloji replikadan müalicədən 72 saat sonra (hpt) toplanmış, homogenləşdirilmiş, birləşdirilmiş və oksidləşdirici stress indikatorlarının yerində histokimyəvi lokalizasiyası, lipid peroksidləşməsi, fermentativ və qeyri-fermentativ antioksidantlar və gen ifadəsi daxil olmaqla, lakin bunlarla məhdudlaşmayaraq, əlavə təhlillər üçün -80 °C-də saxlanılmışdır.
Ağ kif infeksiyasının intensivliyi, Teran və digərləri (2006) tərəfindən dəyişdirilmiş Petzoldt və Dickson şkalasına (1996) əsaslanan 1-9 şkalası (Əlavə Cədvəl S2) istifadə edilərək peyvənddən 21 gün sonra həftəlik olaraq qiymətləndirildi. Qısaca desək, lobya bitkilərinin gövdələri və budaqları peyvənd nöqtəsindən başlayaraq lezyonların düyünlərarası və düyünlər boyunca irəliləməsini izləmək üçün araşdırıldı. Daha sonra lezyonun peyvənd nöqtəsindən gövdə və ya budaq boyunca ən uzaq nöqtəyə qədər olan məsafəsi ölçüldü və lezyonun yerinə əsasən 1-9 bal verildi, burada (1) peyvənd nöqtəsinə yaxın görünən infeksiyanın olmadığını və (2-9) lezyonun ölçüsündə tədricən artım və düyünlər/düyünlərarası proqressiyanı göstərdi (Əlavə Cədvəl S2). Ağ kif infeksiyasının intensivliyi daha sonra 2-ci düsturdan istifadə edərək faizə çevrildi:
Bundan əlavə, xəstəliyin irəliləmə əyrisi altındakı sahə (AUDPC) bu yaxınlarda adi paxla ağ çürüməsi üçün uyğunlaşdırılmış (Chauhan və b., 2020) düsturu (Shaner and Finney, 1977) istifadə edilərək 3-cü tənlikdən istifadə edilərək hesablanmışdır:
Burada Yi = ti zamanı xəstəliyin şiddəti, Yi+1 = növbəti zaman xəstəliyin şiddəti ti+1, ti = ilk ölçmə vaxtı (günlərlə), ti+1 = növbəti ölçmə vaxtı (günlərlə), n = vaxt nöqtələrinin və ya müşahidə nöqtələrinin ümumi sayı. Bitki boyu (sm), bitki başına düşən budaqların sayı və bitki başına düşən yarpaqların sayı daxil olmaqla paxla bitkisinin böyümə parametrləri bütün bioloji təkrarlarda 21 gün ərzində həftəlik olaraq qeydə alınıb.
Hər bioloji replikada yarpaq nümunələri (yuxarıdan ikinci və üçüncü tam inkişaf etmiş yarpaqlar) müalicədən sonrakı 45-ci gündə (son müalicədən 15 gün sonra) toplanmışdır. Hər bioloji replika beş qabdan (hər qabda iki bitki) ibarət idi. Təxminən 500 mq əzilmiş toxuma qaranlıqda 4 °C-də 80% aseton istifadə edərək fotosintetik piqmentlərin (xlorofil a, xlorofil b və karotenoidlər) çıxarılması üçün istifadə edilmişdir. 24 saatdan sonra nümunələr santrifüj edilmişdir və supernatant üç fərqli dalğa uzunluğunda (A470, A646 və A663 nm) udma qabiliyyətini ölçməklə (Lichtenthaler, 1987) UV-160A spektrofotometrindən (Shimadzu Corporation, Yaponiya) istifadə edərək kolorimetrik olaraq xlorofil a, xlorofil b və karotenoid tərkibini təyin etmək üçün toplanmışdır. Nəhayət, fotosintetik piqmentlərin tərkibi Lichtenthaler (1987) tərəfindən təsvir edilən aşağıdakı 4-6 düsturlarından istifadə etməklə hesablanmışdır.
Müalicədən 72 saat sonra (hpt), hidrogen peroksidin (H2O2) və superoksid anionunun (O2•−) yerində histokimyəvi lokalizasiyası üçün hər bioloji replikadan yarpaqlar (yuxarıdan ikinci və üçüncü tam inkişaf etmiş yarpaqlar) toplandı. Hər bioloji replika beş qabdan (hər qabda iki bitki) ibarət idi. Metodun dəqiqliyini, etibarlılığını və təkrar istehsal oluna bilməsini təmin etmək üçün hər bioloji replika ikiqat (iki texniki replika) təhlil edildi. H2O2 və O2•−, Romero-Puertas və digərləri (2004) və Adam və digərləri (1989) tərəfindən kiçik dəyişikliklərlə təsvir edilən metodlara uyğun olaraq, müvafiq olaraq 0,1% 3,3′-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almaniya) və ya nitromavi tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almaniya) istifadə edilərək təyin edildi. H2O2-nin yerində histokimyəvi lokalizasiyası üçün vərəqələr 10 mM Tris buferində (pH 7.8) 0.1% DAB ilə vakuumda infiltrasiya edildi və sonra otaq temperaturunda işıqda 60 dəqiqə inkubasiya edildi. Vərəqələr 4:1 (v/v) etanol:xloroformda (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qahirə, Misir) 0.15% (v/v) TCA-da ağardıldı və sonra qaralana qədər işığa məruz qoyuldu. Eynilə, klapanlar O2•−-nin yerində histokimyəvi lokalizasiyası üçün 0.1 w/v % HBT ehtiva edən 10 mM kalium fosfat buferi (pH 7.8) ilə vakuumda infiltrasiya edildi. Vərəqələr otaq temperaturunda 20 dəqiqə işıqda inkubasiya edildi, sonra yuxarıda göstərildiyi kimi ağardıldı və sonra tünd mavi/bənövşəyi ləkələr görünənə qədər işıqlandırıldı. Nəticədə yaranan qəhvəyi (H2O2 göstəricisi kimi) və ya mavi-bənövşəyi (O2•− göstəricisi kimi) rəngin intensivliyi ImageJ təsvir emalı paketinin Fici versiyasından (http://fiji.sc; 7 mart 2024-cü ildə daxil olmuş) istifadə edilərək qiymətləndirilmişdir.
Malondialdehid (MDA; lipid peroksidləşməsinin markeri kimi) Du və Bramlage (1992) metoduna əsasən kiçik dəyişikliklərlə təyin edilmişdir. Hər bioloji replikanın yarpaqları (yuxarıdan ikinci və üçüncü tam inkişaf etmiş yarpaqlar) müalicədən 72 saat sonra (hpt) toplanmışdır. Hər bioloji replikaya beş qab (hər qabda iki bitki) daxil idi. Metodun dəqiqliyini, etibarlılığını və təkrar istehsalını təmin etmək üçün hər bioloji replika ikiqat (iki texniki replika) təhlil edilmişdir. Qısaca desək, MDA ekstraksiyası üçün 0,5 q üyüdülmüş yarpaq toxuması 0,01% butilləşdirilmiş hidroksitoluol (BHT; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) ehtiva edən 20% triklorosirkə turşusu (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, ABŞ) ilə istifadə edilmişdir. Daha sonra supernatantdakı MDA tərkibi UV-160A spektrofotometrindən (Shimadzu Corporation, Yaponiya) istifadə edərək 532 və 600 nm-də absorbsiyanı ölçməklə kolorimetrik olaraq təyin edildi və sonra nmol g−1 FW kimi ifadə edildi.
Qeyri-fermentativ və fermentativ antioksidantların qiymətləndirilməsi üçün, müalicədən 72 saat sonra (hpt) hər bioloji replikadan yarpaqlar (yuxarıdan ikinci və üçüncü tam inkişaf etmiş yarpaqlar) toplanmışdır. Hər bioloji replika beş qabdan (hər qabda iki bitki) ibarət idi. Hər bioloji nümunə ikiqat nüsxədə təhlil edilmişdir (iki texniki nümunə). İki yarpaq maye azotla üyüdülmüş və fermentativ və qeyri-fermentativ antioksidantların, ümumi amin turşularının, prolin tərkibinin, gen ifadəsinin və oksalat miqdarının təyini üçün birbaşa istifadə edilmişdir.
Ümumi həll olan fenolların miqdarı, Kahkonen və digərləri (1999) tərəfindən təsvir edilən metodun kiçik dəyişiklikləri ilə Folin-Ciocalteu reaktivindən (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) istifadə edilərək təyin edilmişdir. Qısaca desək, təxminən 0,1 q homogenləşdirilmiş yarpaq toxuması 20 ml 80% metanol ilə qaranlıqda 24 saat ərzində ekstraksiya edilmiş və üst qat santrifüqasiyadan sonra toplanmışdır. Nümunə ekstraktının 0,1 ml-i 0,5 ml Folin-Ciocalteu reaktivi (10%) ilə qarışdırılmış, 30 saniyə çalxalanmış və 5 dəqiqə qaranlıqda saxlanılmışdır. Daha sonra hər bir boruya 0,5 ml 20% natrium karbonat məhlulu (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Qahirə, Misir) əlavə edilmiş, yaxşıca qarışdırılmış və otaq temperaturunda qaranlıqda 1 saat inkubasiya edilmişdir. İnkubasiyadan sonra reaksiya qarışığının absorbsiyası UV-160A spektrofotometrindən (Shimadzu Corporation, Yaponiya) istifadə edərək 765 nm-də ölçüldü. Nümunə ekstraktlarında ümumi həll olan fenolların konsentrasiyası qallik turşusu kalibrləmə əyrisindən (Fisher Scientific, Hampton, NH, ABŞ) istifadə edilərək təyin edildi və təzə çəkinin qramına düşən milliqram qallik turşusu ekvivalenti (mq GAE g-1 təzə çəki) kimi ifadə edildi.
Ümumi həll olan flavonoid tərkibi kiçik dəyişikliklərlə Djeridan və digərlərinin (2006) metoduna əsasən təyin edilmişdir. Qısaca desək, yuxarıdakı metanol ekstraktının 0,3 ml-i 0,3 ml 5% alüminium xlorid məhlulu (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, ABŞ) ilə qarışdırılmış, güclü şəkildə qarışdırılmış və sonra otaq temperaturunda 5 dəqiqə inkubasiya edilmiş, ardınca 0,3 ml 10% kalium asetat məhlulu (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qahirə, Misir) əlavə edilmiş, yaxşıca qarışdırılmış və otaq temperaturunda 30 dəqiqə qaranlıqda inkubasiya edilmişdir. İnkubasiyadan sonra reaksiya qarışığının absorbsiyası UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Yaponiya) istifadə edərək 430 nm-də ölçülmüşdür. Nümunə ekstraktlarında ümumi həll olan flavonoidlərin konsentrasiyası rutin kalibrləmə əyrisi (TCI America, Portland, OR, ABŞ) istifadə edilərək təyin edilmiş və sonra təzə çəkidə qram başına milliqram rutin ekvivalenti (mq RE g-1 təzə çəki) kimi ifadə edilmişdir.
Paxla yarpaqlarının ümumi sərbəst amin turşusu tərkibi Yokoyama və Hiramatsu (2003) tərəfindən təklif edilmiş və Sun və digərləri (2006) tərəfindən modifikasiya edilmiş metoda əsasən modifikasiya edilmiş ninhidrin reaktivi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABŞ) istifadə edilərək təyin edilmişdir. Qısaca desək, 0,1 q üyüdülmüş toxuma pH 5,4 buferi ilə ekstraksiya edilmiş və 200 μL supernatant 200 μL ninhidrin (2%) və 200 μL piridin (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, ABŞ) ilə reaksiyaya girmiş, qaynar su hamamında 30 dəqiqə inkubasiya edilmiş, sonra soyudulmuş və UV-160A spektrofotometri (Shimadzu Corporation, Yaponiya) istifadə edilərək 580 nm-də ölçülmüşdür. Digər tərəfdən, prolin Bates metodu ilə təyin edilmişdir (Bates və digərləri, 1973). Prolin 3% sulfosalisil turşusu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABŞ) ilə ekstraksiya edildi və santrifüqdən sonra 0,5 ml supernatant 1 ml buzlaq sirkə turşusu (Fisher Scientific, Hampton, NH, ABŞ) və ninhidrin reaktivi ilə qarışdırıldı, 90°C-də 45 dəqiqə inkubasiya edildi, soyuduldu və yuxarıdakı kimi eyni spektrofotometr istifadə edərək 520 nm-də ölçüldü. Yarpaq ekstraktlarındakı ümumi sərbəst amin turşuları və prolin müvafiq olaraq qlisin və prolin kalibrləmə əyriləri (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) istifadə edilərək təyin edildi və mq/q təzə çəki ilə ifadə edildi.
Antioksidant fermentlərin fermentativ aktivliyini təyin etmək üçün təxminən 500 mq homogenləşdirilmiş toxuma 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) və 7,5% polivinilpirrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) tərkibli 3 ml 50 mM Tris buferi (pH 7,8) ilə ekstraksiya edilmiş, soyuducuda (4 °C) 20 dəqiqə ərzində 10000 × g-də santrifüj edilmiş və supernatant (xam ferment ekstraktı) toplanmışdır (El-Nagar və b., 2023; Osman və b., 2023). Daha sonra katalaza (CAT) 2 ml 0,1 M natrium fosfat buferi (pH 6,5; Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, ABŞ) və 100 μl 269 mM H2O2 məhlulu ilə reaksiyaya girərək, Aebi (1984) metoduna əsasən, kiçik dəyişikliklərlə (El-Nagar və b., 2023; Osman və b., 2023) fermentativ aktivliyini təyin etdi. Quaiakoldan asılı peroksidaza (POX) fermentativ aktivliyi Harrach və b. (2009) metodundan istifadə etməklə təyin edildi. (2008) kiçik dəyişikliklərlə (El-Nagar və b., 2023; Osman və b., 2023) və polifenol oksidazın (PPO) fermentativ aktivliyi 2,2 ml 100 mM natrium fosfat buferi (pH 6.0), 100 μl quaiakol (TCI kimyəvi maddələri, Portland, OR, ABŞ) və 100 μl 12 mM H2O2 ilə reaksiyadan sonra təyin edilmişdir. Metod (El-Nagar və b., 2023; Osman və b., 2023)-dən bir qədər dəyişdirilmişdir. Təhlil, 0,1 M fosfat buferində (pH 6.0) təzə hazırlanmış 3 ml katexol məhlulu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABŞ) (0,01 M) ilə reaksiyadan sonra aparılmışdır. CAT aktivliyi H2O2-nin 240 nm-də (A240) parçalanmasının monitorinqi ilə, POX aktivliyi 436 nm-də (A436) absorbsiya artımının monitorinqi ilə, PPO aktivliyi isə UV-160A spektrofotometrindən (Shimadzu, Yaponiya) istifadə edərək hər 30 saniyədə 495 nm-də (A495) absorbsiya dalğalanmalarının qeyd edilməsi ilə ölçülmüşdür.
Son müalicədən 72 saat sonra lobya yarpaqlarında (yuxarıdan ikinci və üçüncü tam inkişaf etmiş yarpaqlar) peroksisomal katalaz (PvCAT1; GenBank Giriş Nömrəsi KF033307.1), superoksid dismutaza (PvSOD; GenBank Giriş Nömrəsi XM_068639556.1) və qlütation reduktaza (PvGR; GenBank Giriş Nömrəsi KY195009.1) daxil olmaqla üç antioksidantla əlaqəli genin transkript səviyyələrini aşkar etmək üçün real vaxt rejimində RT-PCR istifadə edilmişdir. Qısaca desək, RNT istehsalçının protokoluna uyğun olaraq Simply P Total RNA Extraction Kit (Kat. Nömrəsi BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Çin) istifadə edilərək təcrid edilmişdir. Daha sonra istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq TOP script™ cDNA Synthesis Kit istifadə edilərək kDNA sintez edilmişdir. Yuxarıdakı üç genin praymer ardıcıllığı Əlavə Cədvəl S3-də verilmişdir. PvActin-3 (GenBank giriş nömrəsi: XM_068616709.1) ev təsərrüfatı geni kimi istifadə edilmiş və nisbi gen ifadəsi 2-ΔΔCT metodu ilə hesablanmışdır (Livak və Schmittgen, 2001). Biotik stress (adi paxlalılar və antraknoz göbələyi Colletotrichum lindemuthianum arasında uyğunsuz qarşılıqlı təsir) və abiotik stress (quraqlıq, duzluluq, aşağı temperatur) altında aktin sabitliyi nümayiş etdirilmişdir (Borges və digərləri, 2012).
Əvvəlcə protein-protein BLAST alətindən (BLASTp 2.15.0+) (Altschul və b., 1997, 2005) istifadə edərək S. sclerotiorum-da oksaloasetat asetilhidrolaza (OAH) zülallarının genom genişliyində silika analizini apardıq. Qısaca desək, S. sclerotiorum-da homoloji zülalı (taksid: 5180) xəritələşdirmək üçün sorğu ardıcıllığı kimi Aspergillus fijiensis CBS 313.89-dan (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank giriş nömrəsi XP_040799428.1; 342 amin turşusu) və Penicillium lagena-dan (PlOAH; taxide: 94218; GenBank giriş nömrəsi XP_056833920.1; 316 amin turşusu) OAH istifadə etdik. BLASTp, Milli Biotexnologiya Məlumat Mərkəzinin (NCBI) veb saytındakı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) GenBank-da ən son mövcud olan S. sclerotiorum genom məlumatlarına qarşı aparılmışdır.
Bundan əlavə, S. sclerotiorum-dan proqnozlaşdırılan OAH geni (SsOAH) və A. fijiensis CBS 313.89-dan AfOAH və P. lagena-dan PlOAH-ın təkamül təhlili və filogenetik ağacı MEGA11-də maksimum ehtimal metodu (Tamura və b., 2021) və JTT matrisa əsaslı model (Jones və b., 1992) istifadə edilərək çıxarılmışdır. Filogenetik ağac, S. sclerotiorum-dan proqnozlaşdırılan bütün OAH genlərinin (SsOAH) zülal ardıcıllıqlarının çoxsaylı uyğunlaşdırma təhlili və Məhdudiyyətə Əsaslanan Uyğunlaşdırma Alətindən (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) istifadə edərək sorğu ardıcıllığı ilə birləşdirilmişdir (Papadopoulos və Agarwala, 2007). Bundan əlavə, S. sclerotiorum-dan alınan SsOAH-ın ən yaxşı uyğun amin turşusu ardıcıllıqları ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) istifadə edərək sorğu ardıcıllıqları (AfOAH və PlOAH) ilə uyğunlaşdırıldı (Larkin və b., 2007) və uyğunlaşdırmada qorunan bölgələr ESPript aləti (versiya 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) istifadə edərək vizuallaşdırıldı.
Bundan əlavə, proqnozlaşdırılan funksional nümayəndə domenləri və S. sclerotiorum SsOAH-ın qorunan sahələri InterPro alətindən (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) istifadə edərək interaktiv şəkildə müxtəlif ailələrə təsnif edilmişdir (Blum və b., 2021). Nəhayət, proqnozlaşdırılan S. sclerotiorum SsOAH-ın üçölçülü (3D) struktur modelləşdirilməsi Zülal Homologiyası/Analogiya Tanıma Mühərriki (Phyre2 server versiyası 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley və b., 2015) istifadə edilərək həyata keçirilmiş və SWISS-MODEL serverindən (https://swissmodel.expasy.org/) istifadə edilərək təsdiqlənmişdir (Biasini və b., 2014). Proqnozlaşdırılan üçölçülü strukturlar (PDB formatı) UCSF-Chimera paketindən (versiya 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) istifadə edərək interaktiv şəkildə vizuallaşdırıldı (Pettersen və digərləri, 2004).
Sclerotinia sclerotiorum miseliyalarında oksaloasetat asetilhidrolazanın (SsOAH; GenBank giriş nömrəsi: XM_001590428.1) transkripsiya səviyyəsini təyin etmək üçün kəmiyyət real vaxt flüoresans PZR-dən istifadə edilmişdir. Qısaca desək, S. sclerotiorum PDB olan bir kolbaya inokulyasiya edilmiş və miseliya böyüməsini stimullaşdırmaq üçün 25 ± 2 °C-də 24 saat ərzində 150 ​​dövr/dəq sürətlə və daimi qaranlıqda (24 saat) silkələyən inkubatora (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ABŞ) yerləşdirilmişdir. Bundan sonra, hüceyrələr son IC50 konsentrasiyalarında (müvafiq olaraq təxminən 40 və 3,2 mq/L) L-ornitin və funqisid Rizolex-T ilə müalicə edilmiş və daha sonra eyni şərtlər altında daha 24 saat becərilmişdir. İnkubasiyadan sonra kulturalar 2500 dövr/dəq sürətlə 5 dəqiqə santrifüj edildi və supernatant (göbələk miseli) gen ifadəsi təhlili üçün toplandı. Eynilə, göbələk miseli infeksiyadan 0, 24, 48, 72, 96 və 120 saat sonra yoluxmuş toxumaların səthində ağ kif və pambıq miseli əmələ gətirən yoluxmuş bitkilərdən toplandı. Göbələk miseliumundan RNT çıxarıldı və sonra yuxarıda təsvir edildiyi kimi kDNT sintez edildi. SsOAH üçün praymer ardıcıllıqları Əlavə Cədvəl S3-də verilmişdir. SsActin (GenBank giriş nömrəsi: XM_001589919.1) ev təsərrüfatı geni kimi istifadə edildi və nisbi gen ifadəsi 2-ΔΔCT metodu ilə hesablandı (Livak və Schmittgen, 2001).
Oksalat turşusu kartof dekstroza bulyonunda (PDB) və göbələk patogeni Sclerotinia sclerotiorum olan bitki nümunələrində kiçik dəyişikliklərlə Xu və Zhang (2000) metoduna əsasən təyin edilmişdir. Qısaca desək, S. sclerotiorum izolatları PDB olan kolbalara vurulmuş və sonra misel böyüməsini stimullaşdırmaq üçün silkələyən inkubatorda (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ABŞ) 150 dövr/dəq sürətlə 25 ± 2 °C-də 3-5 gün ərzində daimi qaranlıqda (24 saat) becərilmişdir. İnkubasiyadan sonra göbələk kulturası əvvəlcə Whatman #1 filtr kağızından süzülmüş və sonra qalıq miselyumun çıxarılması üçün 2500 dövr/dəq sürətlə 5 dəqiqə santrifüj edilmişdir. Supernatant toplanmış və oksalatın daha da kəmiyyət təyini üçün 4°C-də saxlanılmışdır. Bitki nümunələrinin hazırlanması üçün təxminən 0,1 q bitki toxuması fraqmentləri üç dəfə distillə edilmiş su ilə (hər dəfə 2 ml) ekstraksiya edilmişdir. Daha sonra nümunələr 2500 dövr/dəq sürətlə 5 dəqiqə santrifüj edildi, üst qat quru şəkildə Whatman №1 filtr kağızından süzüldü və sonrakı analiz üçün toplandı.
Okzalik turşusunun kəmiyyət təhlili üçün reaksiya qarışığı şüşə tıxaclı boruda aşağıdakı ardıcıllıqla hazırlanmışdır: 0,2 ml nümunə (və ya PDB kultura filtratı və ya okzalik turşu standart məhlulu), 0,11 ml bromfenol mavisi (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, ABŞ), 0,198 ml 1 M sulfat turşusu (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Qahirə, Misir) və 0,176 ml 100 mM kalium dixromatı (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, ABŞ), sonra məhlul distillə edilmiş su ilə 4,8 ml-ə qədər durulaşdırılıb, güclü şəkildə qarışdırılıb və dərhal 60 °C su hamamına yerləşdirilib. 10 dəqiqədən sonra reaksiya 0,5 ml natrium hidroksid məhlulu (NaOH; 0,75 M) əlavə edilərək dayandırılıb. Reaksiya qarışığının absorbsiyası (A600) UV-160 spektrofotometrindən (Shimadzu Corporation, Yaponiya) istifadə edilərək 600 nm-də ölçüldü. Kultura filtratlarının və bitki nümunələrinin kəmiyyətləndirilməsi üçün müvafiq olaraq PDB və distillə edilmiş su istifadə edildi. Kultura filtratlarında oksalat turşusu konsentrasiyaları, PDB mühitinin millilitrinə düşən oksalat turşusunun mikroqramı (μg.mL−1) və yarpaq ekstraktlarında təzə çəkiyə düşən oksalat turşusunun mikroqramı (μg.g−1 FW) kimi ifadə edilərək, oksalat turşusu kalibrləmə əyrisi (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABŞ) istifadə edilərək təyin edildi.
Tədqiqat boyunca bütün təcrübələr, başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, hər müalicə üçün altı bioloji təkrar və hər bioloji təkrar üçün beş qab (hər qabda iki bitki) olmaqla tamamilə təsadüfi bir dizaynda (CRD) hazırlanmışdır. Bioloji təkrarlar ikiqat olaraq təhlil edilmişdir (iki texniki təkrar). Texniki təkrarlar eyni təcrübənin təkrarlanabilirliyini yoxlamaq üçün istifadə edilmişdir, lakin saxta təkrarların qarşısını almaq üçün statistik təhlildə istifadə edilməmişdir. Məlumatlar statistik olaraq dəyişkənlik təhlili (ANOVA) və ardınca Tukey-Kramer dürüst əhəmiyyətli fərq (HSD) testi (p ≤ 0.05) istifadə edilərək təhlil edilmişdir. In vitro təcrübələri üçün IC50 və IC99 dəyərləri probit modeli istifadə edilərək hesablanmış və 95% etibarlılıq intervalları hesablanmışdır.
Misirin Əl-Qəbiyyə quberniyasındakı müxtəlif soya tarlalarından cəmi dörd izolat toplanmışdır. PDA mühitində bütün izolatlar kremli ağ miselyum əmələ gətirmiş və tez bir zamanda pambıq kimi ağa çevrilmişdir (Şəkil 1A) və sonra sklerotium mərhələsində bej və ya qəhvəyi rəngə çevrilmişdir. Sklerotiyalar adətən sıx, qara, sferik və ya nizamsız formada, 5,2-7,7 mm uzunluğunda və 3,4-5,3 mm diametrində olur (Şəkil 1B). Dörd izolat 25 ± 2 °C-də 10-12 günlük inkubasiyadan sonra mədəniyyət mühitinin kənarında sklerotiyanın marjinal nümunəsini inkişaf etdirsə də (Şəkil 1A), lövhədəki sklerotiyaların sayı onlar arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olmuşdur (P < 0,001), izolat 3 ən çox sklerotiyaya malik olmuşdur (plitədəki 32,33 ± 1,53 sklerotiya; Şəkil 1C). Eynilə, 3 nömrəli izolyat PDB-də digər izolyatlara nisbətən daha çox oksalik turşusu istehsal etmişdir (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Şəkil 1D). 3 nömrəli izolyat fitopatogen göbələk Sclerotinia sclerotiorum-un tipik morfoloji və mikroskopik xüsusiyyətlərini göstərmişdir. Məsələn, PDA-da 3 nömrəli izolyatın koloniyaları sürətlə böyümüş, krem ​​rəngli ağ (Şəkil 1A), tərs bej və ya açıq qızılbalıq sarı-qəhvəyi rəngdə olmuş və 9 sm diametrli lövhənin səthini tamamilə örtmək üçün 25 ± 2°C-də 6-7 gün tələb olunmuşdur. Yuxarıda göstərilən morfoloji və mikroskopik xüsusiyyətlərə əsasən, 3 nömrəli izolyat Sclerotinia sclerotiorum kimi müəyyən edilmişdir.
Şəkil 1. Ümumi paxlalı bitkilərdən alınan S. sclerotiorum izolatlarının xüsusiyyətləri və patogenliyi. (A) PDA mühitində dörd S. sclerotiorum izolatının miselial böyüməsi, (B) dörd S. sclerotiorum izolatının sklerotiyası, (C) sklerotiyaların sayı (hər lövhədə), (D) PDB mühitində oksalik turşu ifrazı (μg.mL−1) və (E) istixana şəraitində həssas kommersiya paxlalı bitki kultivarı Giza 3 üzərində dörd S. sclerotiorum izolatının xəstəliyin şiddəti (%). Dəyərlər beş bioloji replikanın orta ± SD-ni təmsil edir (n = 5). Müxtəlif hərflər müalicələr arasında statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri göstərir (p < 0.05). (F–H) Tipik ağ kif simptomları müvafiq olaraq 3 nömrəli izolyat (dpi) ilə peyvənddən 10 gün sonra yerüstü gövdələrdə və silikalarda göründü. (I) S. sclerotiorum izolyatı #3-ün daxili transkripsiya olunmuş spacer (ITS) bölgəsinin təkamül təhlili maksimum ehtimal metodu ilə aparılmış və Milli Biotexnologiya Məlumat Mərkəzinin (NCBI) verilənlər bazasından (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) əldə edilmiş 20 istinad izolyatı/ştammı ilə müqayisə edilmişdir. Klasterləşmə xətlərinin üstündəki rəqəmlər bölgənin əhatə dairəsini (%), klasterləşmə xətlərinin altındakı rəqəmlər isə budağın uzunluğunu göstərir.
Bundan əlavə, patogenliyi təsdiqləmək üçün əldə edilən dörd S. sclerotiorum izolatı həssas kommersiya lobya kultivarı Giza 3-ü istixana şəraitində peyvənd etmək üçün istifadə edilmişdir ki, bu da Koch postulatlarına uyğundur (Şəkil 1E). Əldə edilən bütün göbələk izolatları patogen olsa da və yaşıl lobyaya yoluxdura bilsə də (Giza 3-ə baxın), peyvənddən 10 gün sonra (dpi) bütün yerüstü hissələrdə (Şəkil 1F), xüsusən də gövdələrdə (Şəkil 1G) və paxlalarda (Şəkil 1H) tipik ağ kif simptomlarına səbəb olsa da, izolat 3 iki müstəqil təcrübədə ən aqressiv izolat idi. İzolat 3, lobya bitkilərində ən yüksək xəstəlik şiddətinə (%) malik idi (infeksiyadan 7, 14 və 21 gün sonra müvafiq olaraq 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 və 76.7 ± 3.1; Şəkil 1F).
Ən invaziv S. sclerotiorum izolyatı #3-ün müəyyən edilməsi daxili transkripsiya olunmuş spacer (ITS) ardıcıllığına əsasən daha da təsdiqləndi (Şəkil 1I). İzolyat #3 və 20 istinad izolyatı/ştamı arasındakı filogenetik analiz onların arasında yüksək oxşarlıq (>99%) göstərdi. Qeyd etmək lazımdır ki, S. sclerotiorum izolyatı #3 (533 bp) quru noxud toxumlarından təcrid olunmuş Amerika S. sclerotiorum izolyatı LPM36 (GenBank giriş nömrəsi MK896659.1; 540 bp) və Çin S. sclerotiorum izolyatı YKY211 (GenBank giriş nömrəsi OR206374.1; 548 bp) ilə yüksək oxşarlığa malikdir ki, bu da bənövşəyi (Matthiola incana) gövdə çürüməsinə səbəb olur və bunların hamısı dendroqramın yuxarı hissəsində ayrıca qruplaşdırılır (Şəkil 1I). Yeni ardıcıllıq NCBI verilənlər bazasına yerləşdirilib və “Sclerotinia sclerotiorum – izolyat YN-25” (GenBank giriş nömrəsi PV202792) adlandırılıb. Göründüyü kimi, 3-cü izolyat ən invaziv izolyatdır; buna görə də, bu izolyat bütün sonrakı təcrübələrdə tədqiqat üçün seçilib.
Diamin L-ornitinin (Sigma-Aldrich, Darmştadt, Almaniya) müxtəlif konsentrasiyalarda (12.5, 25, 50, 75, 100 və 125 mq/L) S. sclerotiorum izolyatı 3-ə qarşı antibakterial aktivliyi in vitro şəraitdə araşdırılmışdır. Qeyd etmək lazımdır ki, L-ornitinin antibakterial təsir göstərməsi və tədricən S. sclerotiorum hyphae-nin radial böyüməsini dozadan asılı olaraq inhibə etməsi diqqətəlayiqdir (Şəkil 2A, B). Test edilmiş ən yüksək konsentrasiyada (125 mq/L) L-ornitin ən yüksək miselyal böyümə inhibisiya sürətini (99.62 ± 0.27%; Şəkil 2B) nümayiş etdirmişdir ki, bu da test edilmiş ən yüksək konsentrasiyada (10 mq/L) kommersiya funqisidi Rizolex-T-yə (inhibisiya sürəti 99.45 ± 0.39%; Şəkil 2C) bərabərdir və bu da oxşar effektivliyi göstərir.
Şəkil 2. L-ornitinin Sclerotinia sclerotiorum-a qarşı in vitro antibakterial aktivliyi. (A) Müxtəlif konsentrasiyalı L-ornitinin S. sclerotiorum-a qarşı antibakterial aktivliyinin kommersiya funqisidi Rizolex-T (10 mq/L) ilə müqayisəsi. (B, C) Müxtəlif konsentrasiyalı L-ornitinin (12.5, 25, 50, 75, 100 və 125 mq/L) və ya Rizolex-T (2, 4, 6, 8 və 10 mq/L) ilə müalicədən sonra S. sclerotiorum miselyal böyüməsinin inhibə dərəcəsi (%). Dəyərlər beş bioloji təkrarın orta ± SD-ni təmsil edir (n = 5). Müxtəlif hərflər müalicələr arasındakı statistik fərqləri göstərir (p < 0.05). (D, E) Müvafiq olaraq L-ornitinin və kommersiya funqisidi Rizolex-T-nin Probit model reqressiya təhlili. Probit modelinin reqressiya xətti bütöv mavi xətt, etibarlılıq intervalı (95%) isə kəsikli qırmızı xətt kimi göstərilir.
Bundan əlavə, probit reqressiya analizi aparılmış və müvafiq qrafiklər Cədvəl 1 və Şəkil 2D, E-də göstərilmişdir. Qısaca desək, L-ornitinin məqbul meyl dəyəri (y = 2.92x − 4.67) və əlaqəli əhəmiyyətli statistika (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 və p < 0.0001; Şəkil 2D), kommersiya funqisidi Rizolex-T ilə müqayisədə (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 və p < 0.0001) S. sclerotiorum-a qarşı antifungal aktivliyin artdığını göstərir (Cədvəl 1).
Cədvəl 1. S. sclerotiorum-a qarşı L-ornitinin və kommersiya funqisidi olan “Rizolex-T”-nin yarım-maksimum inhibitor konsentrasiyasının (IC50) və IC99 (mq/l) dəyərləri.
Ümumilikdə, L-ornitin (250 mq/L) müalicə olunmamış S. sclerotiorum ilə yoluxmuş bitkilərlə müqayisədə müalicə olunmuş adi lobya bitkilərində ağ kifin inkişafını və şiddətini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır (nəzarət; Şəkil 3A). Qısaca desək, müalicə olunmamış yoluxmuş nəzarət bitkilərinin xəstəliyin şiddəti tədricən artsa da (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 və 92.33 ± 3.06%), L-ornitin təcrübə boyunca xəstəliyin şiddətini (%) müalicədən 7, 14 və 21 gün sonra (dpt) müvafiq olaraq əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır (Şəkil 3A). Eynilə, S. sclerotiorum ilə yoluxmuş lobya bitkiləri 250 mq/L L-ornitinlə müalicə edildikdə, xəstəliyin irəliləmə əyrisi altındakı sahə (AUDPC) müalicə olunmamış nəzarət qrupundakı 1274.33 ± 33.13-dən 281.03 ± 7.95-ə qədər azalmışdır ki, bu da müsbət nəzarət qrupundakı 50 mq/L Rizolex-T funqisidindən (183.61 ± 7.71; Şəkil 3B) bir qədər aşağı idi. Eyni tendensiya ikinci təcrübədə də müşahidə edilmişdir.
Şəkil 3. L-ornitinin ekzogen tətbiqinin istixana şəraitində Sclerotinia sclerotiorum tərəfindən törədilən adi paxlada ağ çürümənin inkişafına təsiri. (A) 250 mq/L L-ornitinlə müalicədən sonra adi paxlada ağ kifin xəstəlik inkişaf əyrisi. (B) L-ornitinlə müalicədən sonra adi paxlada ağ kifin xəstəlik inkişaf əyrisi (AUDPC) altındakı sahə. Dəyərlər beş bioloji təkrarın orta ± SD-ni təmsil edir (n = 5). Müxtəlif hərflər müalicələr arasında statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri göstərir (p < 0.05).
250 mq/L L-ornitinin ekzogen tətbiqi 42 gündən sonra bitkinin hündürlüyünü (Şəkil 4A), bitki başına düşən budaqların sayını (Şəkil 4B) və bitki başına düşən yarpaqların sayını (Şəkil 4C) tədricən artırdı. Ticarət funqisidi Rizolex-T (50 mq/L) tədqiq edilən bütün qida parametrlərinə ən böyük təsir göstərsə də, 250 mq/L L-ornitinin ekzogen tətbiqi müalicə olunmamış nəzarət qrupları ilə müqayisədə ikinci ən böyük təsir göstərdi (Şəkil 4A–C). Digər tərəfdən, L-ornitin müalicəsi fotosintetik piqmentlər xlorofil a (Şəkil 4D) və xlorofil b (Şəkil 4E) tərkibinə əhəmiyyətli təsir göstərməmişdir, lakin mənfi nəzarət (0.44 ± 0.02 mq/q fr çəki) və müsbət nəzarət (0.46 ± 0.02 mq/q fr çəki; Şəkil 4F) ilə müqayisədə ümumi karotenoid tərkibini (0.56 ± 0.03 mq/q fr çəki) bir qədər artırmışdır. Ümumilikdə, bu nəticələr L-ornitinin müalicə olunmuş paxlalılar üçün fitotoksik olmadığını və hətta onların böyüməsini stimullaşdıra biləcəyini göstərir.
Şəkil 4. İstixana şəraitində Sclerotinia sclerotiorum ilə yoluxmuş lobya yarpaqlarının böyümə xüsusiyyətlərinə və fotosintetik piqmentlərinə ekzogen L-ornitinin tətbiqinin təsiri. (A) Bitkinin hündürlüyü (sm), (B) Bitki başına düşən budaqların sayı, (C) Bitki başına düşən yarpaqların sayı, (D) Xlorofil a tərkibi (mq g-1 fr çəki), (E) Xlorofil b tərkibi (mq g-1 fr çəki), (F) Ümumi karotinoid tərkibi (mq g-1 fr çəki). Dəyərlər beş bioloji replikanın orta ± SD-sidir (n = 5). Müxtəlif hərflər müalicələr arasında statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri göstərir (p < 0.05).
Reaktiv oksigen növlərinin (ROS; hidrogen peroksid [H2O2] kimi ifadə olunur) və sərbəst radikalların (superoksid anionları [O2•−] kimi ifadə olunur) yerində histokimyəvi lokalizasiyası göstərdi ki, L-ornitinin (250 mq/L) ekzogen tətbiqi həm müalicə olunmamış yoluxmuş bitkilərin (müvafiq olaraq 173.31 ± 12.06 və 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW), həm də 50 mq/L kommersiya funqisidi Rizolex-T ilə müalicə olunmuş bitkilərin (müvafiq olaraq 170.12 ± 9.50 və 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr çəki) toplanması ilə müqayisədə H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; Şəkil 5A) və O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Şəkil 5B) toplanması əhəmiyyətli dərəcədə azalıb. 72 saatda. Yüksək səviyyəli H2O2 və O2•− hpt altında toplanmışdır (Şəkil 5A, B). Eynilə, TCA əsaslı malondialdehid (MDA) analizi göstərmişdir ki, S. sclerotiorum ilə yoluxmuş paxla bitkiləri yarpaqlarında daha yüksək səviyyəli MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) toplayıb (Şəkil 5C). Lakin, L-ornitinin ekzogen tətbiqi lipid peroksidləşməsini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır ki, bu da müalicə olunmuş bitkilərdə MDA tərkibinin azalması ilə sübut olunur (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Şəkil 5. İstixana şəraitində infeksiyadan 72 saat sonra S. sclerotiorum ilə yoluxmuş lobya yarpaqlarında ekzogen L-ornitinin tətbiqinin oksidləşdirici stressin əsas markerlərinə və qeyri-fermentativ antioksidant müdafiə mexanizmlərinə təsiri. (A) 72 at gücündə hidrogen peroksid (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 at gücündə superoksid anionu (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 at gücündə malondialdehid (MDA; nmol g−1 FW), (D) 72 at gücündə ümumi həll olan fenollar (mg GAE g−1 FW), (E) 72 at gücündə ümumi həll olan flavonoidlər (mg RE g−1 FW), (F) 72 at gücündə ümumi sərbəst amin turşuları (mg g−1 FW) və (G) 72 at gücündə prolin tərkibi (mg g−1 FW). Dəyərlər 5 bioloji təkrarın orta ± standart sapmasını (orta ± SD) təmsil edir (n = 5). Fərqli hərflər müalicələr arasında statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri göstərir (p < 0.05).