Əvvəllər qaraciyər fibrozu olan xəstələrdə bağırsaqdan əldə edilən triptofan metabolit indol-3-propion turşusunun (İPA) serum səviyyələrinin daha aşağı olduğunu bildirmişdik. Bu tədqiqatda piylənmədən əziyyət çəkən qaraciyərlərdə transkriptom və DNT metilomasını serum İPA səviyyələri ilə əlaqəli şəkildə, eləcə də İPA-nın in vitro şəraitdə qaraciyər ulduzşəkilli hüceyrələrinin (HSC) fenotipik inaktivasiyasında rolunu araşdırdıq.
Tədqiqata Kuopio Bariatrik Cərrahiyyə Mərkəzində (KOBS) bariatrik əməliyyat keçirmiş 2-ci tip diabet (T2DM) olmayan 116 piylənmə xəstəsi (yaşı 46,8 ± 9,3 il; BKİ: 42,7 ± 5,0 kq/m²) daxil edilmişdir. Qan dövranında olan IPA səviyyələri maye xromatoqrafiya-kütlə spektrometriyası (LC-MS) ilə ölçülmüş, qaraciyər transkriptom analizi ümumi RNT ardıcıllığı ilə aparılmış və DNT metilasyon analizi Infinium HumanMethylation450 BeadChip istifadə edilərək aparılmışdır. In vitro təcrübələr üçün insan qaraciyər ulduzşəkilli hüceyrələrindən (LX-2) istifadə edilmişdir.
Serum IPA səviyyələri qaraciyərdə apoptotik, mitofagik və uzunömürlülük yollarında iştirak edən genlərin ifadəsi ilə korrelyasiya etmişdir. AKT serin/treonin kinaz 1 (AKT1) geni qaraciyər transkriptində və DNT metilləşmə profillərində ən çox rast gəlinən və dominant qarşılıqlı təsir göstərən gen idi. IPA müalicəsi fibroz, apoptoz və LX-2 hüceyrələrinin sağ qalmasını tənzimlədiyi bilinən genlərin ifadəsini modulyasiya etməklə apoptoza, mitoxondrial tənəffüsün azalmasına və hüceyrə morfologiyasını və mitoxondrial dinamikanı dəyişdirmişdir.
Ümumilikdə, bu məlumatlar IPA-nın potensial terapevtik təsirlərə malik olduğunu və apoptozu induksiya edə və HSC fenotipini qeyri-aktiv vəziyyətə keçirə biləcəyini, bununla da HSC aktivləşməsinə və mitoxondrial metabolizmaya müdaxilə etməklə qaraciyər fibrozunun inhibə edilməsi ehtimalını artırdığını dəstəkləyir.
Piylənmə və metabolik sindromun yayılması metabolik cəhətdən əlaqəli yağlı qaraciyər xəstəliyinin (MASLD) artması ilə əlaqələndirilmişdir; xəstəlik ümumi əhalinin 25%-dən 30%-ə qədərini təsir edir [1]. MASLD etiologiyasının əsas nəticəsi qaraciyər fibrozudur, bu da lifli hüceyrəxarici matrisin (ECM) davamlı toplanması ilə xarakterizə olunan dinamik bir prosesdir [2]. Qaraciyər fibrozunda iştirak edən əsas hüceyrələr dörd məlum fenotip nümayiş etdirən qaraciyər ulduzşəkilli hüceyrələridir (HSC-lər). HSC-lər aktivləşə və sakit formadan yüksək enerji tələb edən proliferativ fibroblast kimi hüceyrələrə transdifferensiasiya oluna bilər, α-hamar əzələ aktininin (α-SMA) və I tip kollagenin (Col-I) ifadəsi artır [5, 6]. Qaraciyər fibrozunun geri dönüşü zamanı aktivləşdirilmiş HSC-lər apoptoz və ya inaktivasiya yolu ilə aradan qaldırılır. Bu proseslərə fibrogen genlərin aşağı tənzimlənməsi və prosurvival genlərin (məsələn, NF-κB və PI3K/Akt siqnal yolları) modulyasiyası [7, 8], eləcə də mitoxondrial dinamika və funksiyadakı dəyişikliklər daxildir [9].
Bağırsaqda istehsal olunan triptofan metaboliti indol-3-propion turşusunun (IPA) serum səviyyələrinin MASLD [10-13] daxil olmaqla insan metabolik xəstəliklərində azaldığı aşkar edilmişdir. IPA qida lifi qəbulu ilə əlaqələndirilir, antioksidan və iltihab əleyhinə təsirləri ilə tanınır və pəhrizdən qaynaqlanan alkoqolsuz steatohepatit (NASH) fenotipini in vivo və in vitro [11-14] zəiflədir. Bəzi dəlillər əvvəlki tədqiqatımızdan gəlir ki, bu da Kuopio Bariatrik Cərrahiyyə Tədqiqatında (KOBS) qaraciyər fibrozu olmayan piylənmiş xəstələrə nisbətən qaraciyər fibrozu olan xəstələrdə serum IPA səviyyələrinin daha aşağı olduğunu göstərmişdir. Bundan əlavə, IPA müalicəsinin insan qaraciyər ulduzşəkilli hüceyrəsi (LX-2) modelində hüceyrə adgeziyasının, hüceyrə miqrasiyasının və hematopoetik kök hüceyrə aktivləşməsinin klassik markerləri olan və potensial hepatoprotektiv metabolit olan genlərin ifadəsini azalda biləcəyini göstərdik [15]. Lakin, IPA-nın HSC apoptozunu və mitoxondrial bioenerjini aktivləşdirərək qaraciyər fibrozunun reqressiyasını necə induksiya etdiyi hələ də məlum deyil.
Burada biz serum IPA-nın piylənmiş, lakin 2-ci tip diabet (KOBS) olmayan şəxslərin qaraciyərində apoptoz, mitofagiya və uzunömürlülük yolları ilə zənginləşdirilmiş genlərin ifadəsi ilə əlaqəli olduğunu nümayiş etdiririk. Bundan əlavə, IPA-nın inaktivasiya yolu vasitəsilə aktivləşdirilmiş hematopoetik kök hüceyrələrin (HSC) təmizlənməsinə və parçalanmasına səbəb ola biləcəyini aşkar etdik. Bu nəticələr IPA-nın yeni bir rolunu ortaya qoyur və onu qaraciyər fibrozunun reqressiyasını təşviq etmək üçün potensial terapevtik hədəfə çevirir.
KOBS kohortasında aparılan əvvəlki bir araşdırma göstərmişdir ki, qaraciyər fibrozu olan xəstələrdə qaraciyər fibrozu olmayan xəstələrlə müqayisədə qan dövranında daha aşağı IPA səviyyələri müşahidə olunmuşdur [15]. 2-ci tip diabetin potensial qarışıq təsirini istisna etmək üçün, davam edən KOBS tədqiqatından 2-ci tip diabeti olmayan 116 piylənmə xəstəsini (orta yaş ± SD: 46,8 ± 9,3 il; BKİ: 42,7 ± 5,0 kq/m2) (Cədvəl 1) tədqiqat populyasiyasına cəlb etdik [16]. Bütün iştirakçılar yazılı məlumatlı razılıq verdilər və tədqiqat protokolu Helsinki Bəyannaməsinə (54/2005, 104/2008 və 27/2010) uyğun olaraq Şimali Savo Şəhər Xəstəxanasının Etika Komitəsi tərəfindən təsdiq edildi.
Qaraciyər biopsiyası nümunələri bariatrik cərrahiyyə zamanı əldə edilmiş və təcrübəli patoloqlar tərəfindən əvvəllər təsvir edilmiş meyarlara [17, 18] uyğun olaraq histoloji olaraq qiymətləndirilmişdir. Qiymətləndirmə meyarları Əlavə Cədvəl S1-də ümumiləşdirilmiş və əvvəllər təsvir edilmişdir [19].
Acqarına serum nümunələri metabolomika analizi üçün hədəflənməmiş maye xromatoqrafiya-kütlə spektrometriyası (LC-MS) ilə təhlil edilmişdir (n = 116). Nümunələr əvvəllər təsvir edildiyi kimi UHPLC-qTOF-MS sistemi (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Almaniya) istifadə edilərək təhlil edilmişdir19. İzopropil spirtinin (IPA) müəyyən edilməsi saxlama müddətinə və MS/MS spektrinin təmiz standartlarla müqayisəsinə əsaslanmışdır. IPA siqnal intensivliyi (pik sahəsi) bütün sonrakı təhlillərdə nəzərə alınmışdır [20].
Bütün qaraciyər RNT ardıcıllığı Illumina HiSeq 2500 istifadə edilərək aparıldı və məlumatlar əvvəllər təsvir edildiyi kimi əvvəlcədən emal edildi [19, 21, 22]. MitoMiner 4.0 verilənlər bazasından seçilmiş 1957 gendən istifadə edərək mitoxondrial funksiyaya/biogenezə təsir edən transkriptlərin hədəflənmiş diferensial ifadə təhlili apardıq [23]. Qaraciyər DNT metilasyonu təhlili əvvəllər təsvir edilən metodologiyadan istifadə edərək Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, ABŞ) istifadə edilərək aparıldı [24, 25].
İnsan qaraciyəri ulduzşəkilli hüceyrələri (LX-2) Prof. Stefano Romeo tərəfindən təqdim edilmiş və DMEM/F12 mühitində (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) becərilib saxlanılmışdır. IPA-nın işçi dozasını seçmək üçün LX-2 hüceyrələri DMEM/F12 mühitində 24 saat ərzində müxtəlif konsentrasiyalı IPA (10 μM, 100 μM və 1 mM; Sigma, 220027) ilə müalicə edilmişdir. Bundan əlavə, IPA-nın HSC-ləri inaktivləşdirmək qabiliyyətini araşdırmaq üçün LX-2 hüceyrələri 24 saat ərzində serumsuz mühitdə 5 ng/ml TGF-β1 (R&D sistemləri, 240-B-002/CF) və 1 mM IPA ilə birlikdə müalicə edilmişdir. Müvafiq vasitə nəzarətləri üçün TGF-β1 müalicəsi üçün 0,1% BSA tərkibli 4 nM HCL və IPA müalicəsi üçün 0,05% DMSO istifadə edilmişdir və hər ikisi kombinasiyalı müalicə üçün birlikdə istifadə edilmişdir.
Apoptoz, istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq, 7-AAD ilə FITC Annexin V Apoptoz Aşkarlama Dəsti (Biolegend, San Diego, CA, ABŞ, Cat# 640922) istifadə edilərək qiymətləndirildi. Qısaca desək, LX-2 (1 × 105 hüceyrə/çuxur) 12 quyulu lövhələrdə bir gecə ərzində becərildi və sonra IPA və ya IPA və TGF-β1-in çoxlu dozası ilə müalicə edildi. Növbəti gün üzən və yapışan hüceyrələr toplandı, tripsinizləşdirildi, PBS ilə yuyuldu, Annexin V bağlayıcı buferində yenidən suspenziya edildi və 15 dəqiqə ərzində FITC-Annexin V və 7-AAD ilə inkubasiya edildi.
Canlı hüceyrələrdəki mitoxondriyalar oksidləşdirici aktivliyə görə Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) istifadə edilərək boyanmışdır. MTR analizləri üçün LX-2 hüceyrələri IPA və TGF-β1 ilə bərabər sıxlıqlarda inkubasiya edilmişdir. 24 saatdan sonra canlı hüceyrələr tripsinizləşdirilmiş, PBS ilə yuyulmuş və daha sonra əvvəllər təsvir edildiyi kimi [26] 37 °C-də 20 dəqiqə ərzində serumsuz mühitdə 100 μM MTR ilə inkubasiya edilmişdir. Canlı hüceyrə morfologiyası təhlili üçün hüceyrə ölçüsü və sitoplazmatik mürəkkəblik müvafiq olaraq irəli səpələnmə (FSC) və yan səpələnmə (SSC) parametrləri istifadə edilərək təhlil edilmişdir.
Bütün məlumatlar (30.000 hadisə) NovoCyte Quanteon (Agilent) istifadə edilərək əldə edilmiş və NovoExpress® 1.4.1 və ya FlowJo V.10 proqram təminatı istifadə edilərək təhlil edilmişdir.
Oksigen sərfiyyatı sürəti (OCR) və hüceyrədənkənar turşulaşma sürəti (ECAR) istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Seahorse XF Cell Mito Stress ilə təchiz olunmuş Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) istifadə edilərək real vaxt rejimində ölçüldü. Qısaca desək, 2 × 104 LX-2 hüceyrə/quyu XF96 hüceyrə kulturası lövhələrinə əkildi. Gecə inkubasiyasından sonra hüceyrələr izopropanol (IPA) və TGF-β1 (Əlavə Metodlar 1) ilə müalicə edildi. Məlumatların təhlili Seahorse XF Cell Enerji Fenotip Test Hesabatı Generatorunu özündə birləşdirən Seahorse XF Wave proqram təminatı istifadə edilərək aparıldı. Bundan Bioenergetik Sağlamlıq İndeksi (BHI) hesablandı [27].
Ümumi RNT kDNT-yə transkripsiya edilmişdir. Xüsusi metodlar üçün [15] istinadına baxın. İnsan 60S ribosomal turşu zülalı P0 (RPLP0) və siklofilin A1 (PPIA) mRNT səviyyələri konstitutiv gen nəzarəti kimi istifadə edilmişdir. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR Sistemi (Thermo Fisher, Landsmeer, Hollandiya) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) və ya Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) ilə istifadə edilmişdir və nisbi gen ifadə qatı müqayisəli Ct dəyər dövriyyəsi parametrləri (ΔΔCt) və ∆∆Ct metodu ilə hesablanmışdır. Primerlərin təfərrüatları S2 və S3 Əlavə Cədvəllərində verilmişdir.
Nüvə DNT-si (ncDNA) və mitoxondrial DNT-si (mtDNA) əvvəllər təsvir edildiyi kimi [28] DNeasy qan və toxuma dəsti (Qiagen) istifadə edilərək çıxarılmışdır. MtDNA-nın nisbi miqdarı, Əlavə Metodlar 2-də ətraflı izah edildiyi kimi, hər bir hədəf mtDNA bölgəsinin üç nüvə DNT bölgəsinin (mtDNA/ncDNA) həndəsi ortalamasına nisbətini hesablamaqla hesablanmışdır. MtDNA və ncDNA üçün primerlərin təfərrüatları Əlavə Cədvəl S4-də verilmişdir.
Canlı hüceyrələr hüceyrəarası və hüceyrədaxili mitoxondrial şəbəkələri vizuallaşdırmaq üçün Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ilə boyanmışdır. LX-2 hüceyrələri (1 × 104 hüceyrə/çuxur) müvafiq şüşə dibli kultura lövhələrində (Ibidi GmbH, Martinsried, Almaniya) şüşə slaydlarda becərilmişdir. 24 saatdan sonra canlı LX-2 hüceyrələri əvvəllər təsvir edildiyi kimi [29] 37 °C-də 20 dəqiqə ərzində 100 μM MTR ilə inkubasiya edilmiş və hüceyrə nüvələri DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ilə boyanmışdır. Mitoxondrial şəbəkələr 37 °C-də 5% CO2 ilə nəmləndirilmiş atmosferdə 63 × NA 1.3 obyektiv istifadə edərək Zeiss LSM 800 konfokal modulu ilə təchiz olunmuş Zeiss Axio Observer tərs mikroskopu (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Almaniya) istifadə edilərək vizuallaşdırılmışdır. Hər nümunə növü üçün on Z seriyalı şəkil əldə etdik. Hər Z seriyası hər biri 9,86 μm qalınlığında olan 30 hissədən ibarətdir. Hər nümunə üçün ZEN 2009 proqram təminatı (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Almaniya) istifadə edilərək on fərqli baxış sahəsinin şəkilləri əldə edildi və Əlavə Metodlar 3-də ətraflı təsvir edilmiş parametrlərə uyğun olaraq ImageJ proqram təminatı (v1.54d) [30, 31] istifadə edilərək mitoxondrial morfologiya təhlili aparıldı.
Hüceyrələr 0,1 M fosfat buferində 2% qlutaraldehid ilə fiksasiya edildi, ardınca 1% osmium tetroksid məhlulu (Sigma Aldrich, MO, ABŞ) ilə fiksasiya edildi, tədricən asetonla susuzlaşdırıldı (Merck, Darmstadt, Almaniya) və nəhayət epoksid qətranına basdırıldı. Ultra nazik kəsiklər hazırlandı və 1% uranil asetat (Merck, Darmstadt, Almaniya) və 1% qurğuşun sitrat (Merck, Darmstadt, Almaniya) ilə boyandı. Ultrastruktur təsvirlər 80 kV sürətləndirici gərginlikdə JEM 2100F EXII ötürücü elektron mikroskopu (JEOL Ltd, Tokio, Yaponiya) istifadə edilərək əldə edildi.
24 saat ərzində IPA ilə müalicə olunmuş LX-2 hüceyrələrinin morfologiyası, Zeiss tərs işıq mikroskopu (Zeiss Axio Vert.A1 və AxioCam MRm, Yena, Almaniya) istifadə edərək 50x böyütmə ilə fazalı kontrast mikroskopiyası ilə təhlil edilmişdir.
Klinik məlumatlar orta ± standart sapma və ya median (kvartillərarası diapazon: IQR) kimi ifadə edilmişdir. Üç tədqiqat qrupu arasındakı fərqləri müqayisə etmək üçün birtərəfli dispersiya təhlili (davamlı dəyişənlər) və ya χ² testi (kateqoriyalı dəyişənlər) istifadə edilmişdir. Çoxsaylı testlərin korreksiyası üçün yalançı müsbət nisbət (FDR) istifadə edilmişdir və FDR < 0.05 olan genlər statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir. CpG DNT metilasyonunu IPA siqnal intensivliyi ilə əlaqələndirmək üçün Spearman korrelyasiya təhlili istifadə edilmişdir və nominal p dəyərləri (p < 0.05) bildirilmişdir.
Yol təhlili, dövran edən serum IPA səviyyələri ilə əlaqəli olan 268 transkript (nominal p < 0.01), 119 mitoxondri ilə əlaqəli transkript (nominal p < 0.05) və 3093 qaraciyər transkriptindən 4350 CpG üçün veb-əsaslı gen dəsti analiz aləti (WebGestalt) istifadə edilərək aparılmışdır. Üst-üstə düşən genləri tapmaq üçün sərbəst mövcud olan Venny DB (versiya 2.1.0) aləti, zülal-zülal qarşılıqlı təsirlərini vizuallaşdırmaq üçün isə StringDB (versiya 11.5) istifadə edilmişdir.
LX-2 təcrübəsi üçün nümunələr D'Agostino-Pearson testindən istifadə edərək normallıq üçün sınaqdan keçirildi. Məlumatlar ən azı üç bioloji replikadan əldə edildi və Bonferroni post hoc testi ilə birtərəfli ANOVA-ya məruz qaldı. 0,05-dən az p-dəyəri statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edildi. Məlumatlar orta ± SD kimi təqdim olunur və təcrübələrin sayı hər şəkildə göstərilir. Bütün təhlillər və qrafiklər Windows üçün GraphPad Prism 8 statistik proqramı (GraphPad Software Inc., versiya 8.4.3, San Dieqo, ABŞ) istifadə edilərək aparıldı.
Əvvəlcə serum IPA səviyyələrinin qaraciyər, bütün bədən və mitoxondrial transkriptlərlə əlaqəsini araşdırdıq. Ümumi transkript profilində serum IPA səviyyələri ilə əlaqəli ən güclü gen MAPKAPK3 idi (FDR = 0.0077; mitogenlə aktivləşdirilmiş protein kinazla aktivləşdirilmiş protein kinaz 3); mitoxondri ilə əlaqəli transkript profilində ən güclü əlaqəli gen AKT1 idi (FDR = 0.7621; AKT serin/treonin kinaz 1) (Əlavə fayl 1 və Əlavə fayl 2).
Daha sonra qlobal transkriptləri (n = 268; p < 0.01) və mitoxondrilərlə əlaqəli transkriptləri (n = 119; p < 0.05) təhlil etdik və nəticədə apoptozu ən əhəmiyyətli kanonik yol kimi müəyyən etdik (p = 0.0089). Serum IPA səviyyələri ilə əlaqəli mitoxondrial transkriptlər üçün apoptoza (FDR = 0.00001), mitofagiyaya (FDR = 0.00029) və TNF siqnal yollarına (FDR = 0.000006) diqqət yetirdik (Şəkil 1A, Cədvəl 2 və Əlavə Şəkillər 1A-B).
İnsan qaraciyərində qlobal, mitoxondri ilə əlaqəli transkriptlərin və DNT metilləşməsinin serum IPA səviyyələri ilə əlaqəli üst-üstə düşən təhlili. A, serum IPA səviyyələri ilə əlaqəli 3092 CpG sahəsinə xəritələşdirilmiş 268 qlobal transkripti, 119 mitoxondri ilə əlaqəli transkripti və DNT metilləşdirilmiş transkripti təmsil edir (qlobal transkriptlər və metilləşdirilmiş DNT üçün p dəyərləri < 0.01 və mitoxondrial transkriptlər üçün p dəyərləri < 0.05). Əsas üst-üstə düşən transkriptlər ortada göstərilir (AKT1 və YKT6). B Ən yüksək qarşılıqlı təsir balı (0.900) olan 13 genin digər genlərlə qarşılıqlı təsir xəritəsi, StringDB onlayn alətindən istifadə edərək serum IPA səviyyələri ilə əhəmiyyətli dərəcədə əlaqəli olan 56 üst-üstə düşən gendən (qara xətt bölgəsi) qurulmuşdur. Yaşıl: Gen Ontologiyası (GO) hüceyrə komponentinə xəritələşdirilmiş genlər: mitoxondrilər (GO:0005739). AKT1, məlumatlara (mətn axtarışı, təcrübələr, verilənlər bazaları və birgə ifadəyə əsaslanaraq) əsaslanaraq digər zülallarla qarşılıqlı təsirlərə görə ən yüksək bala (0.900) malik zülaldır. Şəbəkə düyünləri zülalları, kənarları isə zülallar arasındakı əlaqələri təmsil edir.
Bağırsaq mikrobiota metabolitləri DNT metilləşməsi vasitəsilə epigenetik tərkibi tənzimləyə bildiyindən [32], serum IPA səviyyələrinin qaraciyər DNT metilləşməsi ilə əlaqəli olub-olmadığını araşdırdıq. Serum IPA səviyyələri ilə əlaqəli iki əsas metilləşmə yerinin prolin-serinlə zəngin bölgə 3 (C19orf55) və istilik şoku zülalı ailəsi B (kiçik) üzvü 6 (HSPB6) yaxınlığında olduğunu aşkar etdik (Əlavə fayl 3). 4350 CpG-nin DNT metilləşməsi (p < 0.01) serum IPA səviyyələri ilə əlaqəli idi və uzunömürlülük tənzimləyici yolları ilə zənginləşdirilmişdir (p = 0.006) (Şəkil 1A, Cədvəl 2 və Əlavə Şəkil 1C).
İnsan qaraciyərində serum IPA səviyyələri, qlobal transkriptlər, mitoxondrilərlə əlaqəli transkriptlər və DNT metilləşməsi arasındakı əlaqələrin əsasını təşkil edən bioloji mexanizmləri anlamaq üçün əvvəlki yol analizində müəyyən edilmiş genlərin üst-üstə düşmə analizini apardıq (Şəkil 1A). 56 üst-üstə düşən genin (Şəkil 1A-dakı qara xəttin içərisində) yol zənginləşdirmə analizinin nəticələri göstərdi ki, apoptoz yolu (p = 0.00029) Venn diaqramında göstərildiyi kimi üç analiz üçün ortaq olan iki geni vurğuladı: AKT1 və YKT6 (YKT6 v-SNARE homoloqu). Maraqlıdır ki, AKT1 (cg19831386) və YKT6 (cg24161647) serum IPA səviyyələri ilə müsbət korrelyasiya olunduğunu aşkar etdik (Əlavə fayl 3). Gen məhsulları arasında potensial zülal qarşılıqlı təsirlərini müəyyən etmək üçün giriş olaraq 56 üst-üstə düşən gen arasında ən yüksək ümumi bölgə balı (0.900) olan 13 geni seçdik və qarşılıqlı təsir xəritəsi qurduq. Etibarlılıq səviyyəsinə (marjinal etibarlılıq) görə, ən yüksək bal (0.900) alan AKT1 geni ən yüksəkdə idi (Şəkil 1B).
Yol təhlilinə əsasən, apoptozun əsas yol olduğunu müəyyən etdik, ona görə də IPA müalicəsinin HSC-lərin apoptozuna in vitro təsir edib-etməyəcəyini araşdırdıq. Əvvəllər IPA-nın müxtəlif dozalarının (10 μM, 100 μM və 1 mM) LX-2 hüceyrələri üçün zəhərli olmadığını nümayiş etdirdik [15]. Bu tədqiqat göstərdi ki, 10 μM və 100 μM-də IPA müalicəsi canlı və nekrotik hüceyrələrin sayını artırır. Lakin, nəzarət qrupu ilə müqayisədə, hüceyrə canlılığı 1 mM IPA konsentrasiyasında azalıb, hüceyrə nekrozu sürəti isə dəyişməz qalıb (Şəkil 2A, B). Daha sonra, LX-2 hüceyrələrində apoptozu induksiya etmək üçün optimal konsentrasiyanı tapmaq üçün 24 saat ərzində 10 μM, 100 μM və 1 mM IPA test etdik (Şəkil 2A-E və Əlavə Şəkil 3A-B). Maraqlıdır ki, IPA 10 μM və 100 μM apoptoz nisbətini (%) azaltmışdır, lakin IPA 1 mM nəzarət qrupu ilə müqayisədə gec apoptoz və apoptoz nisbətini (%) artırmışdır və buna görə də sonrakı təcrübələr üçün seçilmişdir (Şəkil 2A–D).
IPA, LX-2 hüceyrələrinin apoptozunu induksiya edir. Apoptoz sürətini və hüceyrə morfologiyasını axın sitometriyası ilə ölçmək üçün Annexin V və 7-AAD ikiqat boyama metodundan istifadə edilmişdir. BA hüceyrələri 24 saat ərzində 10 μM, 100 μM və 1 mM IPA ilə və ya 24 saat ərzində serumsuz mühitdə F–H TGF-β1 (5 ng/ml) və 1 mM IPA ilə inkubasiya edilmişdir. A: canlı hüceyrələr (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotik hüceyrələr (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: erkən (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: gec (Annexin V+/7AAD.+); E, H: apoptoz sürətində ümumi erkən və gec apoptoz hüceyrələrinin faizi (%). Məlumatlar orta ± SD, n = 3 müstəqil təcrübə kimi ifadə edilir. Statistik müqayisələr Bonferroni post hoc testi ilə birtərəfli ANOVA istifadə edilərək aparılmışdır. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Daha əvvəl göstərdiyimiz kimi, 5 ng/ml TGF-β1 klassik marker genlərinin ifadəsini artırmaqla HSC aktivləşməsinə səbəb ola bilər [15]. LX-2 hüceyrələri 5 ng/ml TGF-β1 və 1 mM IPA ilə kombinasiyada müalicə edildi (Şəkil 2E–H). TGF-β1 müalicəsi apoptoz nisbətini dəyişdirmədi, lakin IPA ilə birgə müalicə TGF-β1 müalicəsi ilə müqayisədə gec apoptozu və apoptoz nisbətini (%) artırdı (Şəkil 2E–H). Bu nəticələr göstərir ki, 1 mM IPA TGF-β1 induksiyasından asılı olmayaraq LX-2 hüceyrələrində apoptozu təşviq edə bilər.
Biz LX-2 hüceyrələrində IPA-nın mitoxondrial tənəffüsə təsirini daha da araşdırdıq. Nəticələr göstərdi ki, 1 mM IPA oksigen istehlakı sürəti (OCR) parametrlərini azaldır: qeyri-mitoxondrial tənəffüs, bazal və maksimal tənəffüs, proton sızması və ATF istehsalı, bioenergetik sağlamlıq indeksi (BHI) isə dəyişməyib.
IPA LX-2 hüceyrələrində mitoxondrial tənəffüsü azaldır. Mitoxondrial tənəffüs əyrisi (OCR) mitoxondrial tənəffüs parametrləri (mitoxondrial olmayan tənəffüs, bazal tənəffüs, maksimal tənəffüs, proton sızması, ATP generasiyası, SRC və BHI) kimi təqdim olunur. A və B hüceyrələri müvafiq olaraq 24 saat ərzində 10 μM, 100 μM və 1 mM IPA ilə inkubasiya edildi. C və D hüceyrələri müvafiq olaraq 24 saat ərzində serumsuz mühitdə TGF-β1 (5 ng/ml) və 1 mM IPA ilə inkubasiya edildi. Bütün ölçmələr CyQuant dəsti istifadə edərək DNT tərkibinə uyğunlaşdırıldı. BHI: bioenergetik sağlamlıq indeksi; SRC: tənəffüs ehtiyat tutumu; OCR: oksigen istehlakı sürəti. Məlumatlar orta ± standart sapma (SD), n = 5 müstəqil təcrübə kimi təqdim olunur. Statistik müqayisələr birtərəfli ANOVA və Bonferroni post hoc testi istifadə edilərək aparıldı. *p < 0.05; **p < 0.01; və ***p < 0.001
TGF-β1 ilə aktivləşdirilmiş LX-2 hüceyrələrinin bioenergetik profilinə IPA-nın təsirini daha əhatəli şəkildə anlamaq üçün OCR ilə mitoxondrial oksidləşdirici fosforlaşmanı təhlil etdik (Şəkil 3C, D). Nəticələr göstərdi ki, TGF-β1 müalicəsi nəzarət qrupu ilə müqayisədə maksimum tənəffüs, tənəffüs ehtiyat tutumunu (SRC) və BHI-ni azalda bilər (Şəkil 3C, D). Bundan əlavə, kombinasiya müalicəsi bazal tənəffüsü, proton sızmasını və ATP istehsalını azaltdı, lakin SRC və BHI TGF-β1 ilə müalicə olunanlardan xeyli yüksək idi (Şəkil 3C, D).
Biz həmçinin Seahorse proqram təminatı tərəfindən təmin edilən "Hüceyrə Enerjisi Fenotip Testi"ni həyata keçirdik (Əlavə Şəkil 4A–D). Əlavə Şəkil 3B-də göstərildiyi kimi, həm OCR, həm də ECAR metabolik potensialları TGF-β1 müalicəsindən sonra azalmışdır, lakin nəzarət qrupu ilə müqayisədə kombinasiya və IPA müalicə qruplarında heç bir fərq müşahidə edilməmişdir. Bundan əlavə, nəzarət qrupu ilə müqayisədə kombinasiya və IPA müalicəsindən sonra həm OCR-in bazal, həm də stress səviyyələri azalmışdır (Əlavə Şəkil 4C). Maraqlıdır ki, oxşar bir model kombinasiya terapiyası ilə müşahidə edilmişdir, burada TGF-β1 müalicəsi ilə müqayisədə ECAR-ın bazal və stress səviyyələrində heç bir dəyişiklik müşahidə edilməmişdir (Əlavə Şəkil 4C). HSC-lərdə mitoxondrial oksidləşdirici fosforlaşmanın azalması və kombinasiya müalicəsinin TGF-β1 müalicəsinə məruz qaldıqdan sonra SCR və BHI-ni bərpa etmək qabiliyyəti metabolik potensialı dəyişdirməmişdir (OCR və ECAR). Ümumilikdə, bu nəticələr göstərir ki, IPA HSC-lərdə bioenerjini azalda bilər və bu da IPA-nın HSC fenotipini inaktivasiyaya doğru dəyişən daha aşağı enerjili profilə səbəb ola biləcəyini göstərir (Əlavə Şəkil 4D).
IPA-nın mitoxondrial dinamikaya təsiri mitoxondrial morfologiyanın və şəbəkə əlaqələrinin üçölçülü kəmiyyətləndirilməsi, eləcə də MTR boyanması istifadə edilərək araşdırılmışdır (Şəkil 4 və Əlavə Şəkil 5). Şəkil 4 göstərir ki, nəzarət qrupu ilə müqayisədə TGF-β1 müalicəsi orta səth sahəsini, budaq sayını, ümumi budaq uzunluğunu və budaq qovşağı sayını azaltmışdır (Şəkil 4A və B) və mitoxondrilərin nisbətini sferikdən aralıq morfologiyaya dəyişdirmişdir (Şəkil 4C). Yalnız IPA müalicəsi orta mitoxondrial həcmi azaltmış və mitoxondrilərin nisbətini nəzarət qrupu ilə müqayisədə sferikdən aralıq morfologiyaya dəyişdirmişdir (Şəkil 4A). Əksinə, mitoxondrial membran potensialından asılı MTR (Şəkil 4A və E) ilə qiymətləndirilən sferiklik, orta budaq uzunluğu və mitoxondrial aktivlik dəyişməz qalmışdır və bu parametrlər qruplar arasında fərqlənməmişdir. Ümumilikdə, bu nəticələr göstərir ki, TGF-β1 və IPA müalicəsi canlı LX-2 hüceyrələrində mitoxondrial forma və ölçünü, eləcə də şəbəkə mürəkkəbliyini modulyasiya edir.
IPA, LX-2 hüceyrələrində mitoxondrial dinamikanı və mitoxondrial DNT bolluğunu dəyişdirir. A. Serumsuz mühitdə 24 saat ərzində TGF-β1 (5 ng/ml) və 1 mM IPA ilə inkubasiya edilmiş canlı LX-2 hüceyrələrinin Mitotracker™ Red CMXRos ilə boyanmış mitoxondrial şəbəkələri və DAPI ilə mavi rəngə boyanmış nüvələri göstərən nümayəndəli konfokal görüntüləri. Bütün məlumatlar qrup başına ən azı 15 görüntü ehtiva edirdi. Hər nümunə növü üçün 10 Z-yığın görüntüsü əldə etdik. Hər Z oxu ardıcıllığında hər biri 9,86 μm qalınlığında 30 dilim var idi. Ölçək zolağı: 10 μm. B. Təsvirə adaptiv eşik tətbiq etməklə müəyyən edilmiş nümayəndəli obyektlər (yalnız mitoxondrilər). Hər qrupdakı bütün hüceyrələr üçün kəmiyyət təhlili və mitoxondrial morfoloji şəbəkə əlaqələrinin müqayisəsi aparıldı. C. Mitoxondrial forma nisbətlərinin tezliyi. 0-a yaxın dəyərlər sferik formaları, 1-ə yaxın dəyərlər isə filamentli formaları göstərir. D Mitoxondrial DNT (mtDNT) tərkibi Materiallar və Metodlar bölməsində təsvir edildiyi kimi təyin edilmişdir. E Mitotracker™ Red CMXRos analizi Materiallar və Metodlar bölməsində təsvir edildiyi kimi axın sitometriyası (30.000 hadisə) ilə aparılmışdır. Məlumatlar orta ± SD, n = 3 müstəqil təcrübə kimi təqdim edilmişdir. Statistik müqayisələr birtərəfli ANOVA və Bonferroni post hoc testi istifadə edilərək aparılmışdır. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Daha sonra LX-2 hüceyrələrindəki mtDNT tərkibini mitoxondrial sayın göstəricisi kimi təhlil etdik. Nəzarət qrupu ilə müqayisədə TGF-β1 ilə müalicə olunan qrupda mtDNT tərkibi artmışdır (Şəkil 4D). TGF-β1 ilə müalicə olunan qrupla müqayisədə kombinasiyalı müalicə qrupunda mtDNT tərkibi azalmışdır (Şəkil 4D), bu da IPA-nın mtDNT tərkibini və ehtimal ki, mitoxondrial sayını, eləcə də mitoxondrial tənəffüsü azalda biləcəyini göstərir (Şəkil 3C). Bundan əlavə, IPA kombinasiyalı müalicədə mtDNT tərkibini azaltmış kimi görünürdü, lakin MTR vasitəçiliyi ilə mitoxondrial aktivliyə təsir göstərməmişdir (Şəkil 4A–C).
Biz LX-2 hüceyrələrində fibroz, apoptoz, sağ qalma və mitoxondrial dinamika ilə əlaqəli genlərin mRNA səviyyələri ilə IPA-nın əlaqəsini araşdırdıq (Şəkil 5A–D). Nəzarət qrupu ilə müqayisədə TGF-β1 ilə müalicə olunan qrupda kollagen tip I α2 zənciri (COL1A2), α-hamar əzələ aktin (αSMA), matris metalloproteinaza 2 (MMP2), metalloproteinaza 1-in toxuma inhibitoru (TIMP1) və dinamin 1-ə bənzər gen (DRP1) kimi genlərin ifadəsinin artması müşahidə edildi ki, bu da fibroz və aktivləşmənin artdığını göstərir. Bundan əlavə, nəzarət qrupu ilə müqayisədə TGF-β1 müalicəsi nüvə preqnan X reseptorunun (PXR), kaspaza 8-in (CASP8), MAPKAPK3-ün, B-hüceyrə α inhibitorunun, nüvə faktoru κ geninin işıq peptidinin gücləndiricisinin (NFκB1A) və nüvə faktoru κB kinaz alt vahidi β inhibitorunun (IKBKB) mRNA səviyyələrini azaltdı (Şəkil 5A–D). TGF-β1 müalicəsi ilə müqayisədə, TGF-β1 və IPA ilə kombinasiyalı müalicə COL1A2 və MMP2 ifadəsini azaltmış, lakin PXR, TIMP1, B-hüceyrə limfoması-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β və IKBKB-nin mRNA səviyyələrini artırmışdır. IPA müalicəsi MMP2, Bcl-2 ilə əlaqəli zülal X (BAX), AKT1, optik atrofiya zülalı 1 (OPA1) və mitoxondrial birləşmə zülalı 2 (MFN2) ifadəsini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmışdır, halbuki CASP8, NFκB1A, NFκB1B və IKBKB-nin ifadəsi nəzarət qrupu ilə müqayisədə artmışdır. Lakin, kaspaz-3 (CASP3), apoptotik peptidaz aktivləşdirici faktor 1 (APAF1), mitoxondrial birləşmə zülalı 1 (MFN1) və parçalanma zülalı 1 (FIS1) ifadəsində heç bir fərq aşkar edilməmişdir. Ümumilikdə, bu nəticələr göstərir ki, IPA müalicəsi fibroz, apoptoz, sağ qalma və mitoxondrial dinamika ilə əlaqəli genlərin ifadəsini modulyasiya edir. Məlumatlarımız göstərir ki, IPA müalicəsi LX-2 hüceyrələrində fibrozu azaldır; eyni zamanda, fenotipi inaktivasiyaya doğru dəyişdirərək sağ qalmanı stimullaşdırır.
IPA, LX-2 hüceyrələrində fibroblast, apoptotik, canlılıq və mitoxondrial dinamika genlərinin ifadəsini modulyasiya edir. Histoqramlar, LX-2 hüceyrələrinin serumsuz mühitdə 24 saat ərzində TGF-β1 və IPA ilə induksiyasından sonra endogen nəzarətə (RPLP0 və ya PPIA) nisbətən mRNA ifadəsini göstərir. A fibroblastları, B apoptotik hüceyrələri, C sağ qalan hüceyrələri və D mitoxondrial dinamika geninin ifadəsini göstərir. Məlumatlar orta ± standart sapma (SD), n = 3 müstəqil təcrübə kimi təqdim olunur. Statistik müqayisələr birtərəfli ANOVA və Bonferroni post hoc testi istifadə edilərək aparılmışdır. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Daha sonra, hüceyrə ölçüsündəki dəyişikliklər (FSC-H) və sitoplazmatik mürəkkəblik (SSC-H) axın sitometriyası ilə qiymətləndirildi (Şəkil 6A, B) və IPA müalicəsindən sonra hüceyrə morfologiyasındakı dəyişikliklər transmissiya elektron mikroskopiyası (TEM) və faz kontrast mikroskopiyası ilə qiymətləndirildi (Əlavə Şəkil 6A-B). Gözlənildiyi kimi, TGF-β1 ilə müalicə olunan qrupdakı hüceyrələr nəzarət qrupuna nisbətən ölçüdə artdı (Şəkil 6A, B), bu da kobud endoplazmatik retikulumun (ER*) və faqolizosomların (P) klassik genişlənməsini göstərdi ki, bu da hematopoetik kök hüceyrənin (HSC) aktivləşməsini göstərir (Əlavə Şəkil 6A). Lakin, TGF-β1 ilə müalicə olunan qrupla müqayisədə TGF-β1 və IPA kombinasiyalı müalicə qrupunda hüceyrə ölçüsü, sitoplazmatik mürəkkəblik (Şəkil 6A, B) və ER* tərkibi azalmışdır (Əlavə Şəkil 6A). Bundan əlavə, IPA müalicəsi nəzarət qrupu ilə müqayisədə hüceyrə ölçüsünü, sitoplazmatik mürəkkəbliyi (Şəkil 6A, B), P və ER* tərkibini (Əlavə Şəkil 6A) azaltmışdır. Bundan əlavə, apoptotik hüceyrələrin tərkibi nəzarət qrupu ilə müqayisədə 24 saatlıq IPA müalicəsindən sonra artmışdır (ağ oxlar, Əlavə Şəkil 6B). Ümumilikdə, bu nəticələr göstərir ki, 1 mM IPA HSC apoptozunu stimullaşdıra və TGF-β1 tərəfindən induksiya edilən hüceyrə morfoloji parametrlərindəki dəyişiklikləri geri qaytara bilər və bununla da HSC-nin inaktivasiyası ilə əlaqəli ola bilən hüceyrə ölçüsünü və mürəkkəbliyini tənzimləyə bilər.
IPA, LX-2 hüceyrələrində hüceyrə ölçüsünü və sitoplazmatik mürəkkəbliyi dəyişdirir. Axın sitometriyası analizinin nümunəvi şəkilləri. Analizdə LX-2 hüceyrələri üçün spesifik olan bir qapı strategiyası istifadə edilmişdir: hüceyrə populyasiyasını təyin etmək üçün SSC-A/FSC-A, dubletləri müəyyən etmək üçün FSC-H/FSC-A və hüceyrə ölçüsü və mürəkkəblik analizi üçün SSC-H/FSC-H. Hüceyrələr TGF-β1 (5 ng/ml) və 1 mM IPA ilə serumsuz mühitdə 24 saat inkubasiya edilmişdir. LX-2 hüceyrələri hüceyrə ölçüsü və sitoplazmatik mürəkkəblik analizi üçün aşağı sol kvadrant (SSC-H-/FSC-H-), yuxarı sol kvadrant (SSC-H+/FSC-H-), aşağı sağ kvadrant (SSC-H-/FSC-H+) və yuxarı sağ kvadrant (SSC-H+/FSC-H+) bölünmüşdür. B. Hüceyrə morfologiyası FSC-H (irəli səpələnmə, hüceyrə ölçüsü) və SSC-H (yan səpələnmə, sitoplazmatik mürəkkəblik) (30.000 hadisə) istifadə edərək axın sitometriyası ilə təhlil edilmişdir. Məlumatlar orta ± SD, n = 3 müstəqil təcrübə kimi təqdim olunur. Statistik müqayisələr birtərəfli ANOVA və Bonferroni post hoc testi istifadə edilərək aparılmışdır. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 və ****p < 0.0001
IPA kimi bağırsaq metabolitləri tədqiqatların əsas mövzusuna çevrilib və bu da bağırsaq mikrobiotasında yeni hədəflərin aşkar edilə biləcəyini göstərir. Buna görə də, insanlarda qaraciyər fibrozu ilə əlaqələndirdiyimiz bir metabolit olan IPA-nın [15] heyvan modellərində potensial antifibrotik birləşmə olduğu göstərilmişdir [13, 14]. Burada ilk dəfə olaraq 2-ci tip diabet (T2D) olmayan piylənmiş şəxslərdə serum IPA ilə qlobal qaraciyər transkriptomikası və DNT metilasiyası arasında əlaqəni nümayiş etdiririk, apoptoz, mitofagiya və uzunömürlülüyü, eləcə də qaraciyər homeostazını tənzimləyən mümkün namizəd AKT1 genini vurğulayırıq. Tədqiqatımızın digər bir yeniliyi ondan ibarətdir ki, IPA müalicəsinin apoptoz, hüceyrə morfologiyası, mitoxondrial bioenergetika və LX-2 hüceyrələrində dinamika ilə qarşılıqlı təsirini nümayiş etdirdik ki, bu da HSC fenotipini inaktivasiyaya doğru dəyişən daha aşağı enerji spektrini göstərir və IPA-nı qaraciyər fibrozunu yaxşılaşdırmaq üçün potensial namizədə çevirir.
Biz aşkar etdik ki, apoptoz, mitofagiya və uzunömürlülük qan dövranı serum IPA ilə əlaqəli qaraciyər genlərində zənginləşdirilmiş ən vacib kanonik yollardır. Mitoxondrial keyfiyyətə nəzarət (MQC) sisteminin pozulması mitoxondrial disfunksiyaya, mitofagiyaya və apoptoza səbəb ola bilər və bununla da MASLD-nin baş verməsini təşviq edə bilər[33, 34]. Buna görə də, IPA-nın qaraciyərdə apoptoz, mitofagiya və uzunömürlülük vasitəsilə hüceyrə dinamikasının və mitoxondrial bütövlüyünün qorunmasında iştirak edə biləcəyini fərz edə bilərik. Məlumatlarımız göstərdi ki, üç analizdə iki genin ortaq olduğu aşkar edildi: YKT6 və AKT1. Qeyd etmək lazımdır ki, YKT6 hüceyrə membranının birləşməsi prosesində iştirak edən SNARE zülalıdır. O, autofagosomda STX17 və SNAP29 ilə başlanğıc kompleksi əmələ gətirərək autofagiya və mitofagiyada rol oynayır və bununla da autofagosomların və lizosomların birləşməsi təşviq olunur[35]. Bundan əlavə, YKT6 funksiyasının itirilməsi mitofagiyanın pozulmasına səbəb olur[36], YKT6-nın yüksəlməsi isə hepatosellüler karsinomanın (HCC) irəliləməsi ilə əlaqələndirilir və hüceyrələrin sağ qalmasının artmasına səbəb olur[37]. Digər tərəfdən, AKT1 ən vacib qarşılıqlı təsir göstərən gendir və PI3K/AKT siqnal yolu, hüceyrə dövrü, hüceyrə miqrasiyası, proliferasiyası, fokal adgeziya, mitoxondrial funksiya və kollagen ifrazı da daxil olmaqla qaraciyər xəstəliklərində mühüm rol oynayır[38–40]. Aktivləşdirilmiş PI3K/AKT siqnal yolu hüceyrədənkənar matrisin (ECM) istehsalından məsul olan hüceyrələr olan hematopoetik kök hüceyrələrini (HSC) aktivləşdirə bilər və onun disrequlyasiyası qaraciyər fibrozunun baş verməsinə və irəliləməsinə səbəb ola bilər[40]. Bundan əlavə, AKT p53-asılı hüceyrə apoptozunu inhibə edən əsas hüceyrə sağ qalma amillərindən biridir və AKT aktivləşməsi qaraciyər hüceyrə apoptozunun inhibə edilməsi ilə əlaqələndirilə bilər[41, 42]. Əldə edilən nəticələr göstərir ki, IPA, hepatositlərin apoptoza girməsi və ya sağ qalması arasındakı qərarına təsir edərək qaraciyər mitoxondriləri ilə əlaqəli apoptozda iştirak edə bilər. Bu təsirlər qaraciyər homeostazı üçün vacib olan AKT və/və ya YKT6 namizəd genləri tərəfindən tənzimlənə bilər.
Nəticələrimiz göstərdi ki, 1 mM IPA, TGF-β1 müalicəsindən asılı olmayaraq, LX-2 hüceyrələrində apoptoza səbəb olur və mitoxondrial tənəffüsün azalmasına səbəb olur. Qeyd etmək lazımdır ki, apoptoz fibrozun aradan qaldırılması və hematopoetik kök hüceyrə (HSC) aktivləşməsi üçün əsas yoldur və eyni zamanda qaraciyər fibrozunun geri dönən fizioloji reaksiyasında əsas hadisədir [4, 43]. Bundan əlavə, kombinasiyalı müalicədən sonra LX-2 hüceyrələrində BHI-nin bərpası, IPA-nın mitoxondrial bioenerjinin tənzimlənməsindəki potensial roluna yeni anlayışlar təqdim etdi. İstirahət və qeyri-aktiv şəraitdə hematopoetik hüceyrələr normal olaraq ATF istehsal etmək üçün mitoxondrial oksidləşdirici fosforlaşmadan istifadə edir və aşağı metabolik aktivliyə malikdir. Digər tərəfdən, HSC aktivləşməsi qlikolitik vəziyyətə daxil olmağın enerji tələbatını kompensasiya etmək üçün mitoxondrial tənəffüsü və biosintezi gücləndirir [44]. IPA-nın metabolik potensiala və ECAR-a təsir etməməsi, qlikolitik yolun daha az prioritetli olduğunu göstərir. Eynilə, başqa bir araşdırma göstərdi ki, 1 mM IPA kardiomiositlərdə, insan hepatosit hüceyrə xəttində (Huh7) və insan göbək damar endotel hüceyrələrində (HUVEC) mitoxondrial tənəffüs zəncirinin aktivliyini modulyasiya edə bilir; Lakin, IPA-nın kardiomiositlərdə qlikolizə heç bir təsiri aşkar edilməmişdir ki, bu da IPA-nın digər hüceyrə növlərinin bioenergetiklərinə təsir göstərə biləcəyini göstərir [45]. Buna görə də, 1 mM IPA-nın mtDNT miqdarını dəyişdirmədən fibrogen gen ifadəsini, hüceyrə morfologiyasını və mitoxondrial bioenergetikanı əhəmiyyətli dərəcədə azalda biləcəyi üçün mülayim kimyəvi ayırıcı kimi çıxış edə biləcəyini fərz edirik [46]. Mitoxondrial ayırıcılar kultura ilə induksiya olunan fibrozu və HSC aktivləşməsini inhibə edə bilər [47] və ayırıcı zülallar (UCP) və ya adenin nukleotid translokaz (ANT) kimi müəyyən zülallar tərəfindən tənzimlənən və ya induksiya edilən mitoxondrial ATP istehsalını azalda bilər. Hüceyrə növündən asılı olaraq, bu fenomen hüceyrələri apoptozdan qoruya və/və ya apoptozu təşviq edə bilər [46]. Lakin, hematopoetik kök hüceyrə inaktivasiyasında mitoxondrial ayırıcı kimi IPA-nın rolunu aydınlaşdırmaq üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var.
Daha sonra mitoxondrial tənəffüsdəki dəyişikliklərin canlı LX-2 hüceyrələrində mitoxondrial morfologiyaya əks olunub-olunmadığını araşdırdıq. Maraqlıdır ki, TGF-β1 müalicəsi mitoxondrial nisbəti sferikdən ara formaya dəyişir, mitoxondrial budaqlanma azalır və mitoxondrial parçalanmada əsas amil olan DRP1 ifadəsi artır [48]. Bundan əlavə, mitoxondrial parçalanma ümumi şəbəkə mürəkkəbliyi ilə əlaqələndirilir və birləşmədən bölünməyə keçid hematopoetik kök hüceyrə (HSC) aktivləşməsi üçün vacibdir, mitoxondrial parçalanmanın inhibisiyası isə HSC apoptozuna səbəb olur [49]. Beləliklə, nəticələrimiz göstərir ki, TGF-β1 müalicəsi azalmış budaqlanma ilə mitoxondrial şəbəkə mürəkkəbliyində azalma yarada bilər ki, bu da aktivləşdirilmiş hematopoetik kök hüceyrələri (HSC) ilə əlaqəli mitoxondrial parçalanmada daha çox rast gəlinir. Bundan əlavə, məlumatlarımız göstərdi ki, IPA mitoxondrial nisbəti sferikdən ara formaya dəyişə bilər və bununla da OPA1 və MFN2 ifadəsini azaldır. Tədqiqatlar göstərir ki, OPA1-in aşağı tənzimlənməsi mitoxondrial membran potensialının azalmasına səbəb ola bilər və hüceyrə apoptozunu tetikleyebilir [50]. MFN2-nin mitoxondrial birləşmə və apoptoz proseslərini vasitəçilik etdiyi məlumdur[51]. Əldə edilən nəticələr göstərir ki, TGF-β1 və/və ya IPA tərəfindən LX-2 hüceyrələrinin induksiyası mitoxondrial forma və ölçüləri, eləcə də aktivləşmə vəziyyətini və şəbəkə mürəkkəbliyini modulyasiya edir.
Nəticələrimiz göstərir ki, TGFβ-1 və IPA-nın kombinasiyalı müalicəsi apoptozdan yayınan hüceyrələrdə fibroz, apoptoz və sağ qalma ilə əlaqəli genlərin mRNT ifadəsini tənzimləməklə mtDNT və hüceyrə morfoloji parametrlərini azalda bilər. Həqiqətən də, IPA AKT1-in və COL1A2 və MMP2 kimi vacib fibroz genlərinin mRNT ifadə səviyyəsini azaltmış, lakin apoptozla əlaqəli CASP8 ifadə səviyyəsini artırmışdır. Nəticələrimiz göstərdi ki, IPA müalicəsindən sonra BAX ifadəsi azalmış və TIMP1 ailə alt vahidlərinin, BCL-2 və NF-κB-nin mRNT ifadəsi artmışdır ki, bu da IPA-nın apoptozdan yayınan hematopoetik kök hüceyrələrində (HSC) sağ qalma siqnallarını stimullaşdıra biləcəyini göstərir. Bu molekullar aktivləşdirilmiş hematopoetik kök hüceyrələrdə sağ qalma siqnalları kimi çıxış edə bilər ki, bu da anti-apoptotik zülalların (məsələn, Bcl-2) ifadəsinin artması, pro-apoptotik BAX ifadəsinin azalması və TIMP ilə NF-κB arasında mürəkkəb qarşılıqlı təsir ilə əlaqələndirilə bilər [5, 7]. IPA təsirlərini PXR vasitəsilə göstərir və biz TGF-β1 və IPA ilə kombinasiyalı müalicənin PXR mRNA ifadə səviyyələrini artırdığını və bu da HSC aktivləşməsinin basdırılmasını göstərdiyini aşkar etdik. Aktivləşdirilmiş PXR siqnalının həm in vivo, həm də in vitro HSC aktivləşməsini inhibə etdiyi məlumdur [52, 53]. Nəticələrimiz göstərir ki, IPA apoptozu təşviq etməklə, fibroz və mitoxondrial metabolizmanı azaltmaqla və aktivləşdirilmiş HSC fenotipini inaktiv hala çevirən tipik proseslər olan sağ qalma siqnallarını artırmaqla aktivləşdirilmiş HSC-lərin təmizlənməsində iştirak edə bilər. IPA-nın apoptozdakı potensial mexanizmi və rolu üçün digər mümkün izah, onun disfunksiyalı mitoxondriləri əsasən mitofagiya (daxili yol) və NF-κB sağ qalma siqnal yolu ilə birbaşa əlaqəli olan xarici TNF siqnal yolu (Cədvəl 1) vasitəsilə təmizləməsidir (Əlavə Şəkil 7). Maraqlıdır ki, IPA ilə əlaqəli zənginləşdirilmiş genlər apoptoz yolunda pro-apoptotik və pro-sağ qalma siqnallarını induksiya edə bilir [54], bu da IPA-nın bu genlərlə qarşılıqlı təsir göstərərək apoptotik yolu və ya sağ qalmanı induksiya edə biləcəyini göstərir. Lakin, IPA-nın HSC aktivləşməsi zamanı apoptozu və ya sağ qalmanı necə induksiya etməsi və onun mexaniki yolları hələ də aydın deyil.
IPA, bağırsaq mikrobiotası vasitəsilə qida triptofanından əmələ gələn mikrobial metabolitdir. Tədqiqatlar göstərir ki, o, bağırsaq mühitində iltihab əleyhinə, antioksidant və epigenetik tənzimləyici xüsusiyyətlərə malikdir.[55] Tədqiqatlar göstərir ki, IPA bağırsaq baryer funksiyasını modulyasiya edə və oksidləşdirici stressi azalda bilər ki, bu da onun yerli fizioloji təsirlərinə töhfə verə bilər.[56] Əslində, IPA qan dövranı vasitəsilə hədəf orqanlara daşınır və IPA triptofan, serotonin və indol törəmələri ilə oxşar əsas metabolit quruluşuna malik olduğundan, IPA rəqabətli metabolik nəticələrə səbəb olan metabolik təsirlər göstərir.[52] IPA fermentlər və ya reseptorlar üzərində bağlanma yerləri üçün triptofan mənşəli metabolitlərlə rəqabət apara bilər və bu da normal metabolik yolları poza bilər. Bu, onun terapevtik pəncərəsini daha yaxşı başa düşmək üçün onun farmakokinetikası və farmakodinamikası ilə bağlı əlavə tədqiqatların aparılmasına ehtiyac olduğunu göstərir.[57] Bunun hematopoetik kök hüceyrələrində (HSC) də baş verib-verməyəcəyi hələ məlum deyil.
Tədqiqatımızın bəzi məhdudiyyətlərinin olduğunu qəbul edirik. Xüsusilə IPA ilə əlaqəli əlaqələri araşdırmaq üçün 2-ci tip diabet (2-ci tip diabet) olan xəstələri istisna etdik. Bunun tapıntılarımızın 2-ci tip diabet və inkişaf etmiş qaraciyər xəstəliyi olan xəstələrə geniş tətbiqini məhdudlaşdırdığını qəbul edirik. İnsan serumundakı IPA-nın fizioloji konsentrasiyası 1-10 μM olsa da [11, 20], 1 mM IPA konsentrasiyası ən yüksək toksik olmayan konsentrasiyaya [15] və ən yüksək apoptoz sürətinə əsasən seçildi və nekrotik hüceyrə populyasiyasının faizində heç bir fərq olmadı. Bu tədqiqatda IPA-nın suprafizioloji səviyyələri istifadə olunsa da, hazırda IPA-nın effektiv dozası ilə bağlı fikir birliyi yoxdur [52]. Nəticələrimiz əhəmiyyətli olsa da, IPA-nın daha geniş metabolik taleyi tədqiqatın aktiv sahəsi olaraq qalır. Bundan əlavə, serum IPA səviyyələri ilə qaraciyər transkriptlərinin DNT metilləşməsi arasındakı əlaqəyə dair tapıntılarımız yalnız hematopoetik kök hüceyrələrindən (HSC) deyil, həm də qaraciyər toxumalarından əldə edilmişdir. Biz transkriptom analizindən əldə etdiyimiz əvvəlki tapıntılara əsasən insan LX-2 hüceyrələrindən istifadə etməyi seçdik ki, IPA hematopoetik kök hüceyrə (HSC) aktivləşməsi ilə əlaqələndirilir [15] və HSC-lər qaraciyər fibrozunun inkişafında iştirak edən əsas hüceyrələrdir. Qaraciyər birdən çox hüceyrə növündən ibarətdir, buna görə də IPA-nın rolunu və onun digər qaraciyər hüceyrə növləri ilə qarşılıqlı təsirini öyrənmək üçün hepatosit-HSC-immun hüceyrə birgə becərmə sistemi, kaspaz aktivləşməsi və DNT parçalanması, eləcə də zülal səviyyəsi də daxil olmaqla təsir mexanizmi kimi digər hüceyrə modelləri nəzərdən keçirilməlidir.