nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS dəstəyi məhduddur. Ən yaxşı təcrübə üçün ən son brauzer versiyasından istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyi) tövsiyə edirik. Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün bu saytda stillər və ya JavaScript olmayacaq.
Hidrogen sulfidin (H2S) insan orqanizminə çoxsaylı fizioloji və patoloji təsirləri var. Natrium hidrosulfid (NaHS) bioloji təcrübələrdə H2S-in təsirlərini qiymətləndirmək üçün farmakoloji vasitə kimi geniş istifadə olunur. NaHS məhlullarından H2S itkisi cəmi bir neçə dəqiqə çəksə də, bəzi heyvan tədqiqatlarında NaHS məhlulları içməli suda H2S üçün donor birləşmələri kimi istifadə edilmişdir. Bu tədqiqatda bəzi müəlliflərin təklif etdiyi kimi, siçovul/siçan şüşələrində hazırlanmış 30 μM NaHS konsentrasiyası olan içməli suyun ən azı 12-24 saat ərzində sabit qalıb-qalmadığı araşdırılmışdır. İçməli suda NaHS (30 μM) məhlulu hazırlayın və dərhal siçovul/siçan suyu şüşələrinə tökün. Metilen mavisi metodundan istifadə edərək sulfid tərkibini ölçmək üçün su şüşəsinin ucundan və içərisindən 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 və 24 saat ərzində nümunələr götürülmüşdür. Bundan əlavə, erkək və dişi siçovullara iki həftə ərzində NaHS (30 μM) vuruldu və serum sulfid konsentrasiyaları ilk həftə ərzində və ikinci həftənin sonunda hər iki gündən bir ölçüldü. Su şüşəsinin ucundan alınan nümunədəki NaHS məhlulu qeyri-sabit idi; 12 və 24 saatdan sonra müvafiq olaraq 72% və 75% azalıb. Su şüşələrinin içərisindən alınan nümunələrdə NaHS-in azalması 2 saat ərzində əhəmiyyətli deyildi; lakin 12 və 24 saatdan sonra müvafiq olaraq 47% və 72% azalıb. NaHS inyeksiyası erkək və dişi siçovulların serum sulfid səviyyəsinə təsir göstərməyib. Nəticə olaraq, içməli sudan hazırlanmış NaHS məhlulları H2S bağışlamaq üçün istifadə edilməməlidir, çünki məhlul qeyri-sabitdir. Bu tətbiq yolu heyvanları qeyri-müntəzəm və gözləniləndən daha az miqdarda NaHS-ə məruz qoyacaq.
Hidrogen sulfid (H2S) 1700-cü ildən bəri toksin kimi istifadə olunur; lakin onun endogen biosiqnal molekulu kimi mümkün rolu 1996-cı ildə Abe və Kimura tərəfindən təsvir edilmişdir. Son üç onillikdə H2S-in müxtəlif insan sistemlərində çoxsaylı funksiyaları aydınlaşdırılmış və bu da H2S donor molekullarının müəyyən xəstəliklərin müalicəsində və ya idarə olunmasında klinik tətbiqlərə malik ola biləcəyinin anlaşılmasına gətirib çıxarmışdır; son icmal üçün Chirino və digərlərinə baxın.
Natrium hidrosulfid (NaHS) bir çox hüceyrə kulturası və heyvan tədqiqatlarında H2S-in təsirlərini qiymətləndirmək üçün farmakoloji vasitə kimi geniş istifadə edilmişdir5,6,7,8. Lakin, NaHS ideal H2S donoru deyil, çünki məhlulda sürətlə H2S/HS-ə çevrilir, polisulfidlərlə asanlıqla çirklənir və asanlıqla oksidləşir və buxarlanır4,9. Bir çox bioloji təcrübələrdə NaHS suda həll olur və bu da passiv buxarlanma və H2S10,11,12 itkisinə, H2S11,12,13-ün spontan oksidləşməsinə və fotolizə14 səbəb olur. Orijinal məhluldakı sulfid H2S11-in buxarlanması səbəbindən çox tez itir. Açıq qabda H2S-in yarımparçalanma dövrü (t1/2) təxminən 5 dəqiqədir və konsentrasiyası dəqiqədə təxminən 13% azalır10. NaHS məhlullarından hidrogen sulfidin itirilməsi cəmi bir neçə dəqiqə çəksə də, bəzi heyvan tədqiqatlarında NaHS məhlulları 1-21 həftə ərzində içməli suda hidrogen sulfid mənbəyi kimi istifadə edilmiş və hər 12-24 saatdan bir NaHS tərkibli məhlul əvəz edilmişdir.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Bu təcrübə elmi tədqiqat prinsiplərinə uyğun deyil, çünki dərman dozaları digər növlərdə, xüsusən də insanlarda istifadəsinə əsaslanmalıdır.27
Biotibb sahəsində klinikayaqədərki tədqiqatlar xəstələrə göstərilən qayğının və ya müalicə nəticələrinin keyfiyyətini artırmağı hədəfləyir. Lakin, əksər heyvan tədqiqatlarının nəticələri hələ insanlara tərcümə olunmayıb28,29,30. Bu translyasiya uğursuzluğunun səbəblərindən biri heyvan tədqiqatlarının metodoloji keyfiyyətinə diqqət yetirilməməsidir30. Buna görə də, bu tədqiqatın məqsədi bəzi tədqiqatlarda iddia edildiyi və ya təklif edildiyi kimi, siçovul/siçan su şüşələrində hazırlanmış 30 μM NaHS məhlullarının içməli suda 12-24 saat ərzində sabit qala biləcəyini araşdırmaq idi.
Bu tədqiqatdakı bütün təcrübələr İranda laboratoriya heyvanlarının baxımı və istifadəsi üçün dərc olunmuş qaydalara uyğun olaraq aparılmışdır31. Bu tədqiqatdakı bütün təcrübi hesabatlar da ARRIVE qaydalarına uyğun idi32. Şəhid Beheşti Tibb Elmləri Universitetinin Endokrin Elmləri İnstitutunun Etika Komitəsi bu tədqiqatdakı bütün təcrübi prosedurları təsdiqləmişdir.
Sink asetat dihidrat (CAS: 5970-45-6) və susuz dəmir xlorid (CAS: 7705-08-0) Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Fransa) şirkətlərindən alınıb. Natrium hidrosulfid hidrat (CAS: 207683-19-0) və N,N-dimetil-p-fenilendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) Sigma-Aldrich (Sent-Luis, MO, ABŞ) şirkətlərindən alınıb. İzofluran Piramal (Bethlehem, PA, ABŞ) şirkətlərindən alınıb. Xlorid turşusu (HCl) isə Merck (Darmstadt, Almaniya) şirkətlərindən alınıb.
İçməli suda NaHS (30 μM) məhlulu hazırlayın və dərhal siçovul/siçan su şüşələrinə tökün. Bu konsentrasiya NaHS-i H2S mənbəyi kimi istifadə edən çoxsaylı nəşrlərə əsasən seçilib; Müzakirə bölməsinə baxın. NaHS müxtəlif miqdarda hidratasiya suyu (yəni NaHS•xH2O) ehtiva edə bilən hidratlaşdırılmış bir molekuldur; istehsalçıya görə, tədqiqatımızda istifadə edilən NaHS faizi 70,7% (yəni NaHS•1,3 H2O) idi və biz hesablamalarımızda bu dəyəri nəzərə aldıq, burada susuz NaHS-in molekulyar çəkisi olan 56,06 q/mol molekulyar çəkidən istifadə etdik. Hidratasiya suyu (kristallaşma suyu da adlanır) kristal quruluşu təşkil edən su molekullarıdır33. Hidratların anhidratlarla müqayisədə fərqli fiziki və termodinamik xüsusiyyətləri var34.
İçməli suya NaHS əlavə etməzdən əvvəl həlledicinin pH-nı və temperaturunu ölçün. NaHS məhlulunu dərhal heyvan qəfəsindəki siçovul/siçan su şüşəsinə tökün. Sulfid tərkibini ölçmək üçün nümunələr su şüşəsinin ucundan və içərisindən 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 və 24 saat ərzində götürülmüşdür. Sulfid ölçmələri hər nümunə götürüldükdən dərhal sonra aparılmışdır. Bəzi tədqiqatlar su borusunun kiçik məsamə ölçüsünün H2S buxarlanmasını minimuma endirə biləcəyini göstərdiyi üçün borunun ucundan nümunələr əldə etdik15,19. Bu problem şüşədəki məhlula da aid görünür. Lakin, bu, daha yüksək buxarlanma sürətinə malik və özünü oksidləşdirən su şüşəsinin boynundakı məhlul üçün belə deyildi; əslində heyvanlar əvvəlcə bu suyu içirdilər.
Tədqiqatda erkək və dişi Wistar siçovullarından istifadə edilmişdir. Siçovullar polipropilen qəfəslərdə (hər qəfəsdə 2-3 siçovul) standart şəraitdə (temperatur 21-26 °C, rütubət 32-40%) 12 saat işıqlı (səhər 7-dən axşam 7-yə qədər) və 12 saat qaranlıq (axşam 7-dən səhər 7-yə qədər) saxlanılmışdır. Siçovulların kran suyuna sərbəst çıxışı var idi və standart yeməklə (Khorak Dam Pars Company, Tehran, İran) qidalanırdı. Yaşı uyğun (6 aylıq) dişi (n=10, bədən çəkisi: 190-230 q) və erkək (n=10, bədən çəkisi: 320-370 q) Wistar siçovulları təsadüfi olaraq nəzarət və NaHS (30 μM) ilə müalicə olunmuş qruplara (qrup başına n=5) bölünmüşdür. Nümunə ölçüsünü müəyyən etmək üçün əvvəlki təcrübəni və güc təhlilini birləşdirən KISS (Keep It Simple, Stupid) yanaşmasından istifadə etdik35. Əvvəlcə 3 siçovul üzərində pilot tədqiqat apardıq və orta serum ümumi sulfid səviyyəsini və standart sapmanı (8.1 ± 0.81 μM) təyin etdik. Daha sonra, 80% güc nəzərə alınmaqla və iki tərəfli 5% əhəmiyyətlilik səviyyəsini fərz edərək, Festinq tərəfindən eksperimental heyvanların nümunə ölçüsünü hesablamaq üçün təklif edilən əvvəlcədən müəyyən edilmiş dəyərlə 2.02 standartlaşdırılmış effekt ölçüsünə uyğun gələn ilkin nümunə ölçüsünü (əvvəlki ədəbiyyata əsasən n = 5) təyin etdik35. Bu dəyəri SD-yə (2.02 × 0.81) vurduqdan sonra proqnozlaşdırılan aşkar edilə bilən effekt ölçüsü (1.6 μM) 20% oldu ki, bu da məqbuldur. Bu o deməkdir ki, n = 5/qrup qruplar arasında 20% orta dəyişikliyi aşkar etmək üçün kifayətdir. Siçovullar Excel proqram təminatının 36 təsadüfi funksiyasından istifadə edərək təsadüfi olaraq nəzarət və NaSH ilə işlənmiş qruplara bölündülər (Əlavə Şəkil 1). Nəticə səviyyəsində korlama aparıldı və biokimyəvi ölçmələri aparan tədqiqatçılar qrup tapşırıqlarından xəbərsiz idilər.
Hər iki cinsdən olan NaHS qrupları 2 həftə ərzində içməli suda hazırlanmış 30 μM NaHS məhlulu ilə müalicə edildi; Hər 24 saatdan bir təzə məhlul verildi və bu müddət ərzində bədən çəkisi ölçüldü. Birinci və ikinci həftələrin sonunda hər iki gündən bir izofluran anesteziyası altında bütün siçovulların quyruq uclarından qan nümunələri toplandı. Qan nümunələri 3000 q-da 10 dəqiqə ərzində santrifüj edildi, serum ayrıldı və serum üre, kreatinin (Cr) və ümumi sulfidin sonrakı ölçülməsi üçün –80°C-də saxlanıldı. Serum üre fermentativ üreaz metodu ilə təyin edildi və serum kreatinin ticari olaraq mövcud olan dəstlərdən (Man Company, Tehran, İran) və avtomatik analizatordan (Selectra E, seriya nömrəsi 0-2124, Hollandiya) istifadə edərək fotometrik Jaffe metodu ilə təyin edildi. Karbamid və Cr üçün daxili və intertest dəyişmə əmsalları 2,5%-dən az idi.
Metilen mavisi (MB) metodu içməli suda və NaHS tərkibli serumda ümumi sulfidi ölçmək üçün istifadə olunur; MB toplu məhlullarda və bioloji nümunələrdə sulfidi ölçmək üçün ən çox istifadə edilən metoddur11,37. MB metodu ümumi sulfid hovuzunu38 qiymətləndirmək və sulu fazada H2S, HS- və S2 şəklində qeyri-üzvi sulfidləri39 ölçmək üçün istifadə edilə bilər. Bu metodda kükürd sink asetatın iştirakı ilə sink sulfid (ZnS) şəklində çökdürülür11,38. Sink asetat çöküntüsü sulfidləri digər xromoforlardan ayırmaq üçün ən çox istifadə edilən metoddur11. ZnS güclü turşulu şəraitdə HCl11 istifadə edərək yenidən həll edilmişdir. Sulfid, 670 nm-də spektrofotometrik olaraq aşkar edilən MB boyası əmələ gətirmək üçün dəmir xlorid (Fe3+ oksidləşdirici maddə kimi çıxış edir) ilə katalizləşdirilən reaksiyada DMPD ilə 1:2 stexiometrik nisbətdə reaksiyaya girir40,41. MB metodunun aşkarlama həddi təxminən 1 μM11-dir.
Bu tədqiqatda hər nümunədən (məhlul və ya serum) 100 μL boruya əlavə edildi; sonra 200 μL sink asetat (distillə edilmiş suda 1% w/v), 100 μL DMPD (7.2 M HCl-də 20 mM) və 133 μL FeCl3 (1.2 M HCl-də 30 mM) əlavə edildi. Qarışıq qaranlıqda 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edildi. Məhlul 10.000 q-da 10 dəqiqə santrifüj edildi və supernatantın absorbsiyası mikroplitə oxuyucusu (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, ABŞ) istifadə edilərək 670 nm-də oxundu. Sulfid konsentrasiyaları ddH2O-da NaHS-in (0–100 μM) kalibrləmə əyrisi istifadə edilərək təyin edildi (Əlavə Şəkil 2). Ölçmələr üçün istifadə edilən bütün məhlullar təzə hazırlanmışdı. Sulfid ölçmələri üçün analizdaxili və analizlərarası variasiya əmsalları müvafiq olaraq 2,8% və 3,4% təşkil etmişdir. Həmçinin, zənginləşdirilmiş nümunə metodundan istifadə edərək natrium tiosulfat tərkibli içməli su və serum nümunələrindən çıxarılan ümumi sulfidi də təyin etdik42. Natrium tiosulfat tərkibli içməli su və serum nümunələri üçün çıxarılan sulfid müvafiq olaraq 91 ± 1,1% (n = 6) və 93 ± 2,4% (n = 6) təşkil etmişdir.
Statistik təhlil Windows üçün GraphPad Prism proqram təminatı versiyası 8.0.2 (GraphPad Software, San Diego, CA, ABŞ, www.graphpad.com) istifadə edilərək aparılmışdır. NaHS əlavə edilməzdən əvvəl və sonra içməli suyun temperaturunu və pH-nı müqayisə etmək üçün qoşa t-testdən istifadə edilmişdir. NaHS tərkibli məhluldakı H2S itkisi ilkin udulmadan faiz azalması kimi hesablanmışdır və itkinin statistik cəhətdən əhəmiyyətli olub-olmadığını qiymətləndirmək üçün birtərəfli təkrarlanan ölçü ANOVA və ardınca Dunnettin çoxsaylı müqayisə testi apardıq. Bədən çəkisi, serum sidik cövhəri, serum kreatinin və zamanla ümumi serum sulfidi müxtəlif cinslərdən olan nəzarət və NaHS ilə müalicə olunmuş siçovullar arasında ikitərəfli qarışıq (arası-daxili) ANOVA və ardınca Bonferroni post-hoc testi istifadə edilərək müqayisə edilmişdir. İki quyruqlu P dəyərləri < 0.05 statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir.
İçməli suyun pH-ı NaHS əlavə edilməzdən əvvəl 7,60 ± 0,01, NaHS əlavə edilməzdən sonra isə 7,71 ± 0,03 olmuşdur (n = 13, p = 0,0029). İçməli suyun temperaturu 26,5 ± 0,2 idi və NaHS əlavə edildikdən sonra 26,2 ± 0,2-yə düşdü (n = 13, p = 0,0128). İçməli suda 30 μM NaHS məhlulu hazırlayın və su şüşəsində saxlayın. NaHS məhlulu qeyri-sabitdir və konsentrasiyası zamanla azalır. Su şüşəsinin boğazından nümunə götürülərkən ilk saat ərzində əhəmiyyətli dərəcədə azalma (68,0%) müşahidə edildi və məhluldakı NaHS miqdarı 12 və 24 saatdan sonra müvafiq olaraq 72% və 75% azalıb. Su şüşələrindən götürülmüş nümunələrdə NaHS-də azalma 2 saata qədər əhəmiyyətli olmadı, lakin 12 və 24 saatdan sonra müvafiq olaraq 47% və 72% azalıb. Bu məlumatlar göstərir ki, nümunə götürmə yerindən asılı olmayaraq, içməli suda hazırlanmış 30 μM məhluldakı NaHS faizi 24 saatdan sonra ilkin dəyərin təxminən dörddə birinə qədər azalıb (Şəkil 1).
Siçovul/siçan şüşələrində içməli suda NaHS məhlulunun (30 μM) stabilliyi. Məhlul hazırlandıqdan sonra, su şüşəsinin ucundan və içərisindən nümunələr götürülmüşdür. Məlumatlar orta ± SD (n = 6/qrup) kimi təqdim olunur. * və #, 0 zamanla müqayisədə P < 0.05. Su şüşəsinin fotoşəkilində şüşənin ucu (açılışı ilə) və gövdəsi göstərilir. Ucluğun həcmi təxminən 740 μL-dir.
Təzə hazırlanmış 30 μM məhluldakı NaHS konsentrasiyası 30,3 ± 0,4 μM idi (diapazon: 28,7–31,9 μM, n = 12). Lakin, 24 saatdan sonra NaHS konsentrasiyası daha aşağı bir dəyərə düşdü (orta: 3,0 ± 0,6 μM). Şəkil 2-də göstərildiyi kimi, siçovulların məruz qaldığı NaHS konsentrasiyası tədqiqat dövründə sabit olmamışdır.
Dişi siçovulların bədən çəkisi zamanla əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (nəzarət qrupunda 205,2 ± 5,2 q-dan 213,8 ​​± 7,0 q-a və NaHS ilə müalicə olunan qrupda 204,0 ± 8,6 q-dan 211,8 ± 7,5 q-a qədər); lakin, NaHS müalicəsi bədən çəkisinə heç bir təsir göstərməmişdir (Şəkil 3). Erkək siçovulların bədən çəkisi zamanla əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (nəzarət qrupunda 338,6 ± 8,3 q-dan 352,4 ± 6,0 q-a və NaHS ilə müalicə olunan qrupda 352,4 ± 5,9 q-dan 363,2 ± 4,3 q-a qədər); lakin, NaHS müalicəsi bədən çəkisinə heç bir təsir göstərməmişdir (Şəkil 3).
NaHS (30 μM) tətbiqindən sonra dişi və erkək siçovullarda bədən çəkisindəki dəyişikliklər. Məlumatlar orta ± SEM kimi təqdim olunur və Bonferroni post hoc testi ilə iki tərəfli qarışıq (aralıq) dispersiya təhlili istifadə edilərək müqayisə edilmişdir. Hər qrupda hər cinsdən n = 5.
Tədqiqat boyunca nəzarət və NaSH ilə müalicə olunmuş siçovullarda serum üre və kreatin fosfat konsentrasiyaları müqayisə edilə bilən idi. Bundan əlavə, NaSH müalicəsi serum üre və kreatinxrom konsentrasiyalarına təsir göstərməmişdir (Cədvəl 1).
Əsas serum ümumi sulfid konsentrasiyaları nəzarət və NaHS ilə müalicə olunmuş erkək (8.1 ± 0.5 μM vs. 9.3 ± 0.2 μM) və dişi (9.1 ± 1.0 μM vs. 6.1 ± 1.1 μM) siçovullarda müqayisə edilə bilən idi. 14 gün ərzində NaHS tətbiqi nə erkək, nə də dişi siçovullarda serum ümumi sulfid səviyyələrinə heç bir təsir göstərməmişdir (Şəkil 4).
NaHS (30 μM) tətbiqindən sonra erkək və dişi siçovullarda serum ümumi sulfid konsentrasiyalarında dəyişikliklər. Məlumatlar orta ± SEM kimi təqdim olunur və Bonferroni post hoc testi ilə iki tərəfli qarışıq (daxili-daxili) dispersiya təhlili istifadə edilərək müqayisə edilmişdir. Hər cins, n = 5/qrup.
Bu tədqiqatın əsas nəticəsi odur ki, tərkibində NaHS olan içməli su qeyri-sabitdir: siçovul/siçan su şüşələrinin ucundan və içərisindən nümunə götürüldükdən 24 saat sonra ilkin ümumi sulfid miqdarının yalnız dörddə biri aşkar edilə bilər. Bundan əlavə, siçovullar NaHS məhlulunda H2S itkisi səbəbindən qeyri-sabit NaHS konsentrasiyalarına məruz qalıblar və içməli suya NaHS əlavə edilməsi bədən çəkisinə, serum karbamidinə və kreatin xromuna və ya ümumi serum sulfidinə təsir etməyib.
Bu tədqiqatda, içməli suda hazırlanmış 30 μM NaHS məhlullarından H2S itkisi sürəti saatda təxminən 3% təşkil etmişdir. Tamponlu məhlulda (10 mM PBS-də 100 μM natrium sulfid, pH 7.4), sulfid konsentrasiyasının 8 saat ərzində zamanla 7% azaldığı bildirilmişdir11. Əvvəllər NaHS-in qarın içinə yeridilməsini müdafiə edərək, içməli suda 54 μM NaHS məhlulundan sulfid itkisi sürətinin saatda təxminən 2.3% olduğunu bildirmişdik (hazırlandıqdan sonra ilk 12 saatda 4%/saat və son 12 saatda 1.4%/saat)8. Əvvəlki tədqiqatlar43 əsasən buxarlanma və oksidləşmə səbəbindən NaHS məhlullarından sabit H2S itkisi aşkar etmişdir. Baloncuklar əlavə edilmədən belə, əsas məhluldakı sulfid H2S buxarlanması səbəbindən sürətlə itirilir11. Tədqiqatlar göstərir ki, təxminən 30-60 saniyə davam edən durulaşdırma prosesi zamanı buxarlanma səbəbindən H2S-in təxminən 5-10%-i itirilir6. Məhluldan H2S-in buxarlanmasının qarşısını almaq üçün tədqiqatçılar bir sıra tədbirlər görüblər, o cümlədən məhlulun yavaşca qarışdırılması12, hazır məhlulun plastik təbəqə ilə örtülməsi6 və H2S-in buxarlanma sürəti hava-maye sərhədindən asılı olduğundan məhlulun havaya məruz qalmasını minimuma endirmək.13 H2S-in spontan oksidləşməsi əsasən suda çirk olan keçid metal ionları, xüsusən də dəmir dəmir səbəbindən baş verir.13 H2S-in oksidləşməsi polisulfidlərin (kovalent rabitə ilə əlaqəli kükürd atomları)11 əmələ gəlməsinə səbəb olur. Oksidləşməsinin qarşısını almaq üçün tərkibində H2S olan məhlullar deoksigenləşdirilmiş həlledicilərdə hazırlanır44,45 və sonra deoksigenləşməni təmin etmək üçün 20-30 dəqiqə argon və ya azotla təmizlənir.11,12,37,44,45,46 Dietilentriaminpentasirkə turşusu (DTPA) aerob məhlullarda HS-in avtooksidləşməsinin qarşısını alan metal xelatlayıcıdır (10-4 M). DTPA olmadıqda, HS-in avtooksidləşmə sürəti 25°C-də təxminən 3 saat ərzində təxminən 50% təşkil edir37,47. Bundan əlavə, 1e-sulfidin oksidləşməsi ultrabənövşəyi işıqla katalizləşdirildiyindən, məhlul buz üzərində saxlanılmalı və işıqdan qorunmalıdır11.
Şəkil 5-də göstərildiyi kimi, NaHS suda həll olduqda Na+ və HS-6-ya dissosiasiya olunur; bu dissosiasiya reaksiyanın temperaturdan asılı olan pK1 ilə müəyyən edilir: pK1 = 3.122 + 1132/T, burada T 5 ilə 30°C arasında dəyişir və Kelvin (K) dərəcəsi ilə ölçülür, K = °C + 273.1548. HS- yüksək pK2-yə malikdir (pK2 = 19), buna görə də pH < 96.49-da S2- əmələ gəlmir və ya çox az miqdarda əmələ gəlir. Bunun əksinə olaraq, HS- əsas kimi çıxış edir və H2O molekulundan H+ qəbul edir, H2O isə turşu kimi çıxış edir və H2S və OH--yə çevrilir.
NaHS məhlulunda (30 µM) həll olmuş H2S qazının əmələ gəlməsi. aq, sulu məhlul; g, qaz; l, maye. Bütün hesablamalar suyun pH-nın = 7.0 və suyun temperaturunun = 20 °C olduğunu fərz edir. BioRender.com ilə yaradılıb.
NaHS məhlullarının qeyri-sabit olduğuna dair dəlillərə baxmayaraq, bir neçə heyvan tədqiqatında içməli suda NaHS məhlullarından H2S donor birləşməsi kimi istifadə edilmişdir15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 müdaxilə müddəti 1 həftədən 21 həftəyə qədər dəyişir (Cədvəl 2). Bu tədqiqatlar zamanı NaHS məhlulu hər 12 saatdan bir, 15, 17, 18, 24, 25 saat və ya 24 saatdan bir, 19, 20, 21, 22, 23 saatdan bir yeniləndi. Nəticələrimiz göstərdi ki, siçovullar NaHS məhlulundan H2S itkisi səbəbindən qeyri-sabit dərman konsentrasiyalarına məruz qalırlar və siçovulların içməli suyundakı NaHS tərkibi 12 və ya 24 saat ərzində əhəmiyyətli dərəcədə dəyişib (Şəkil 2-yə baxın). Bu tədqiqatlardan ikisi suda H2S səviyyəsinin 24 saat ərzində sabit qaldığını və ya 12 saat ərzində yalnız 2-3% H2S itkisinin müşahidə olunduğunu bildirmişdir, lakin onlar dəstəkləyici məlumatlar və ya ölçmə detalları təqdim etməmişdir. İki tədqiqat göstərmişdir ki, su şüşələrinin kiçik diametri H2S buxarlanmasını minimuma endirə bilər15,19. Lakin nəticələrimiz göstərdi ki, bu, su şüşəsindən H2S itkisini 12-24 saat əvəzinə yalnız 2 saat gecikdirə bilər. Hər iki tədqiqat qeyd edir ki, içməli suda NaHS səviyyəsinin dəyişmədiyini fərz edirik, çünki suda rəng dəyişikliyi müşahidə etməmişik; buna görə də H2S-in hava ilə oksidləşməsi əhəmiyyətli deyildi19,20. Təəccüblüdür ki, bu subyektiv metod NaHS-in konsentrasiyasının zamanla dəyişməsini ölçmək əvəzinə, onun suda sabitliyini qiymətləndirir.
NaHS məhlulunda H2S itkisi pH və temperaturla əlaqədardır. Tədqiqatımızda qeyd edildiyi kimi, NaHS-in suda həll edilməsi qələvi məhlulun əmələ gəlməsinə səbəb olur50. NaHS suda həll edildikdə, həll olmuş H2S qazının əmələ gəlməsi pH dəyərindən asılıdır6. Məhlulun pH-ı nə qədər aşağı olarsa, H2S qaz molekulları kimi mövcud olan NaHS-in nisbəti bir o qədər çox olar və sulu məhluldan bir o qədər çox sulfid itirilir11. Bu tədqiqatların heç birində NaHS üçün həlledici kimi istifadə edilən içməli suyun pH-ı bildirilməyib. Əksər ölkələr tərəfindən qəbul edilən ÜST tövsiyələrinə görə, içməli suyun pH-ı 6,5–8,551 aralığında olmalıdır1. Bu pH aralığında H2S-in spontan oksidləşmə sürəti təxminən on dəfə artır13. NaHS-in bu pH aralığında suda həll edilməsi 1 ilə 22,5 μM arasında həll olunmuş H2S qaz konsentrasiyasına səbəb olacaq ki, bu da NaHS-i həll etməzdən əvvəl suyun pH-ının monitorinqinin vacibliyini vurğulayır. Bundan əlavə, yuxarıdakı tədqiqatda bildirilən temperatur diapazonu (18–26 °C) məhluldakı həll olmuş H2S qazının konsentrasiyasında təxminən 10% dəyişiklik yaradacaq, çünki temperatur dəyişiklikləri pK1-i dəyişdirir və pK1-dəki kiçik dəyişikliklər həll olmuş H2S qazının konsentrasiyasına əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərə bilər48. Bundan əlavə, bəzi tədqiqatların uzun müddət davam etməsi (5 ay)22 və bu müddət ərzində böyük temperatur dəyişkənliyinin gözlənilməsi də bu problemi daha da artırır.
Bir21 tədqiqat istisna olmaqla, bütün tədqiqatlarda içməli suda 30 μM NaHS məhlulu istifadə edilmişdir. İstifadə olunan dozanı (yəni 30 μM) izah etmək üçün bəzi müəlliflər sulu fazada NaHS-in H2S qazının eyni konsentrasiyasını istehsal etdiyini və H2S-in fizioloji diapazonunun 10 ilə 100 μM arasında olduğunu, buna görə də bu dozanın fizioloji diapazonda olduğunu qeyd etmişlər15,16. Digərləri isə 30 μM NaHS-in plazma H2S səviyyəsini fizioloji diapazonda, yəni 5–300 μM19,20 saxlaya biləcəyini izah etmişlər. Bəzi tədqiqatlarda H2S-in təsirlərini öyrənmək üçün istifadə edilən 30 μM (pH = 7.0, T = 20 °C) suda NaHS konsentrasiyasını nəzərdən keçiririk. Həll olmuş H2S qazının konsentrasiyasının 14.7 μM olduğunu hesablaya bilərik ki, bu da ilkin NaHS konsentrasiyasının təxminən 50%-ni təşkil edir. Bu dəyər digər müəlliflər tərəfindən eyni şərtlər altında hesablanmış dəyərə bənzəyir13,48.
Bizim tədqiqatımızda NaHS tətbiqi bədən çəkisini dəyişmədi; bu nəticə erkək siçanlarda aparılan digər tədqiqatların nəticələri ilə uyğundur22,23 və erkək siçovullarda18; Lakin iki tədqiqatda NaSH-ın nefrektomiya edilmiş siçovullarda azalmış bədən çəkisini bərpa etdiyi bildirilmişdir24,26, digər tədqiqatlarda isə NaSH tətbiqinin bədən çəkisinə təsiri bildirilməmişdir15,16,17,19,20,21,25. Bundan əlavə, bizim tədqiqatımızda NaSH tətbiqi serum üre və kreatin xrom səviyyələrinə təsir göstərməmişdir ki, bu da başqa bir hesabatın nəticələri ilə uyğundur25.
Tədqiqat göstərib ki, 2 həftə ərzində içməli suya NaHS əlavə edilməsi erkək və dişi siçovullarda ümumi serum sulfid konsentrasiyalarına təsir göstərməyib. Bu tapıntı Sen və digərlərinin (16) nəticələri ilə uyğun gəlir: içməli suda 30 μM NaHS ilə 8 həftəlik müalicə nəzarət siçovullarında plazma sulfid səviyyələrinə təsir göstərməyib; lakin onlar bu müdaxilənin nefrektomiya edilmiş siçanların plazmasında azalmış H2S səviyyələrini bərpa etdiyini bildiriblər. Li və digərləri (22) həmçinin bildiriblər ki, 5 ay ərzində içməli suda 30 μM NaHS ilə müalicə yaşlı siçanlarda plazma sərbəst sulfid səviyyələrini təxminən 26% artırıb. Digər tədqiqatlar içməli suya NaHS əlavə edildikdən sonra dövran edən sulfiddə dəyişikliklər barədə məlumat verməyib.
Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 istifadə edilərək yeddi tədqiqat bildirilmişdir, lakin hidratasiya suyu haqqında əlavə məlumat verilməmişdir və beş tədqiqatda hazırlama metodlarında istifadə edilən NaHS mənbəyi qeyd edilməmişdir17,18,24,25,26. NaHS hidratlaşdırılmış bir molekuldur və onun hidratasiya tərkibi dəyişə bilər ki, bu da müəyyən bir molarlıq məhlulu hazırlamaq üçün tələb olunan NaHS miqdarına təsir göstərir. Məsələn, tədqiqatımızda NaHS tərkibi NaHS•1.3 H2O idi. Beləliklə, bu tədqiqatlarda faktiki NaHS konsentrasiyaları bildirilənlərdən daha aşağı ola bilər.
“Belə qısaömürlü birləşmənin bu qədər uzunmüddətli təsiri necə ola bilər?” Pozgay və digərləri21 siçanlarda NaHS-in kolitə təsirini qiymətləndirərkən bu sualı vermişlər. Onlar ümid edirlər ki, gələcək tədqiqatlar bu suala cavab verə biləcək və NaHS məhlullarının H2S-dən əlavə daha sabit polisulfidlər və NaHS21-in təsirini vasitəçilik edən disulfidlər ehtiva edə biləcəyini fərziyyələndirəcəklər. Başqa bir ehtimal isə məhlulda qalan çox aşağı NaHS konsentrasiyalarının da faydalı təsir göstərə bilməsidir. Əslində, Olson və digərləri qanda H2S-in mikromolyar səviyyələrinin fizioloji olmadığını və nanomolyar diapazonda olmalı və ya tamamilə olmamalı olduğuna dair dəlillər təqdim etmişlər13. H2S, bir çox zülalın funksiyasına, sabitliyinə və lokalizasiyasına təsir edən geri dönən post-translyasiya modifikasiyası olan zülal sulfasiyası vasitəsilə təsir göstərə bilər52,53,54. Əslində, fizioloji şəraitdə bir çox qaraciyər zülalının təxminən 10%-dən 25%-ə qədəri sulfilləşdirilir53. Hər iki tədqiqat NaHS-in sürətlə məhv olduğunu etiraf edir19,23, lakin təəccüblü şəkildə bildirir ki, "biz gündəlik olaraq dəyişdirərək içməli suda NaHS konsentrasiyasını idarə etdik".23 Bir tədqiqat təsadüfən "NaHS standart H2S donorudur və klinik praktikada H2S-in özünü əvəz etmək üçün istifadə olunur"18 deyə bildirib.
Yuxarıdakı müzakirə göstərir ki, NaHS məhluldan buxarlanma, oksidləşmə və fotoliz yolu ilə itirilir və buna görə də məhluldan H2S itkisini azaltmaq üçün bəzi təkliflər verilir. Birincisi, H2S-in buxarlanması qaz-maye sərhədindən13 və məhlulun pH səviyyəsindən11 asılıdır; buna görə də, buxarlanma itkisini minimuma endirmək üçün su şüşəsinin boynunu əvvəllər təsvir edildiyi kimi15,19 mümkün qədər kiçik etmək olar və buxarlanma itkisini minimuma endirmək üçün suyun pH-ı məqbul yuxarı həddə (yəni 6,5–8,551) tənzimlənə bilər11. İkincisi, H2S-in spontan oksidləşməsi oksigenin təsiri və içməli suda keçid metal ionlarının olması13 səbəbindən baş verir, buna görə də içməli suyun arqon və ya azotla deoksigenləşdirilməsi44,45 və metal xelatörlərin istifadəsi37,47 sulfidlərin oksidləşməsini azalda bilər. Üçüncüsü, H2S-in fotoparçalanmasının qarşısını almaq üçün su şüşələri alüminium folqa ilə bükülə bilər; Bu təcrübə həmçinin streptozotosin kimi işığa həssas materiallara da aiddir55. Nəhayət, qeyri-üzvi sulfid duzları (NaHS, Na2S və CaS) əvvəllər bildirildiyi kimi içməli suda həll edilmək əvəzinə, qaz vasitəsilə verilə bilər56,57,58; tədqiqatlar göstərib ki, siçovullara qaz vasitəsilə verilən radioaktiv natrium sulfid yaxşı sorulur və demək olar ki, bütün toxumalara paylanır59. Bu günə qədər əksər tədqiqatlar qeyri-üzvi sulfid duzlarını qarın boşluğuna yeridib; lakin bu yol klinik şəraitdə nadir hallarda istifadə olunur60. Digər tərəfdən, oral yol insanlarda ən çox yayılmış və üstünlük verilən qəbul yoludur61. Buna görə də, H2S donorlarının gəmiricilərdəki təsirlərini oral qaz vasitəsilə qiymətləndirməyi tövsiyə edirik.
Məhdudiyyət ondan ibarətdir ki, biz MB metodundan istifadə edərək sulu məhlul və serumda sulfid ölçdük. Sulfidin ölçülməsi üsullarına yod titrlənməsi, spektrofotometriya, elektrokimyəvi metod (potensiometriya, amperometriya, kulometrik metod və amperometrik metod) və xromatoqrafiya (qaz xromatoqrafiyası və yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası) daxildir ki, bunlardan ən çox istifadə edilən metod MB spektrofotometriya metodudur62. Bioloji nümunələrdə H2S-in ölçülməsi üçün MB metodunun məhdudiyyəti ondan ibarətdir ki, o, bütün kükürd tərkibli birləşmələri ölçür və sərbəst H2S63-ü yox, çünki bu, turşu şəraitində aparılır və bu da bioloji mənbədən kükürdün çıxarılmasına səbəb olur64. Lakin, Amerika İctimai Səhiyyə Assosiasiyasına görə, MB suda sulfidin ölçülməsi üçün standart metoddur65. Buna görə də, bu məhdudiyyət NaHS tərkibli məhlulların qeyri-sabitliyi ilə bağlı əsas nəticələrimizə təsir etmir. Bundan əlavə, tədqiqatımızda NaHS tərkibli su və serum nümunələrində sulfid ölçmələrinin bərpası müvafiq olaraq 91% və 93% təşkil etmişdir. Bu dəyərlər əvvəllər bildirilən diapazonlarla (77–92)66 uyğun gəlir ki, bu da məqbul analitik dəqiqliyi göstərir42. Qeyd etmək lazımdır ki, klinikayaqədərki tədqiqatlarda yalnız erkək heyvan tədqiqatlarına həddindən artıq etibar etməmək67 və mümkün olduqda həm erkək, həm də dişi siçovulları daxil etmək üçün Milli Səhiyyə İnstitutlarının (NIH) təlimatlarına uyğun olaraq həm erkək, həm də dişi siçovullardan istifadə etdik68. Bu məqam başqaları tərəfindən də vurğulanmışdır69,70,71.
Nəticə olaraq, bu tədqiqatın nəticələri göstərir ki, içməli sudan hazırlanmış NaHS məhlulları qeyri-sabitliyinə görə H2S yaratmaq üçün istifadə edilə bilməz. Bu tətbiq yolu heyvanları qeyri-sabit və gözləniləndən aşağı NaHS səviyyələrinə məruz qoyardı; buna görə də, tapıntılar insanlara tətbiq olunmaya bilər.
Cari tədqiqat zamanı istifadə edilən və/və ya təhlil edilən məlumat dəstləri müvafiq müəllifdən ağlabatan tələb olduqda əldə edilə bilər.
Szabo, K. Hidrogen sulfid (H2S) tədqiqatının xronologiyası: ətraf mühit toksindən bioloji vasitəçiyə qədər. Biokimya və Farmakologiya 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. və Kimura, H. Hidrogen sulfidin endogen neyromodulyator kimi mümkün rolu. Neyrologiya Jurnalı, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. və Papapetropoulos, A. Hidrogen sulfidin məməli hüceyrələrində, toxumalarında və orqanlarında fizioloji rolu. Fiziologiya və Molekulyar Biologiya üzrə İcmallar 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB və Kashfi, K. Azot oksidi və hidrogen sulfid üçün hüceyrə çatdırılma sistemlərinin inkişaf edən vədi: fərdiləşdirilmiş tibbin yeni bir dövrü. Biokimya və Farmakologiya 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. və b. Yavaş buraxılan hidrogen sulfid donorunun uzunmüddətli tətbiqi miokard işemiyası/reperfuziya zədələnməsinin qarşısını ala bilər. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM və Hermann, A. BK kanal fosforlaşması hidrogen sulfidin (H2S) həssaslığını tənzimləyir. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM və Hermann, A. Hidrogen sulfid siçovul hipofiz şiş hüceyrələrində kalsiumla aktivləşdirilmiş kalium (BK) kanal aktivliyini artırır. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. və b. Hidrogen sulfid, 2-ci tip diabetli siçovullarda miokard işemiyası-reperfuziya zədələnməsinə qarşı nitritin qoruyucu təsirini artırır. Azot oksidi 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. və b. H2S donor kimyasındakı tendensiyalar və onun ürək-damar xəstəliklərinə təsiri. Antioksidantlar 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF və Olson, KR (2012). Bioloji təcrübələrdə hidrogen sulfidin passiv itkiləri. Analitik Biokimya 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. və b. Fizioloji nümunələrdə hidrogen sulfid ölçmələrinin kimyəvi aspektləri. Biochimica və Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Təbii sularda hidrogen sulfidin spektrofotometrik təyini. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Hidrogen sulfidin kimyası və biologiyası üzrə praktiki təlim. “Antioksidantlar.” Redoks Siqnalizi. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).