Sekretor yolda zülalların çeşidlənməsi hüceyrə bölmələşməsini və homeostazını qorumaq üçün vacibdir. Qabıq vasitəçiliyi ilə çeşidlənməyə əlavə olaraq, kinesinlərin sekretor daşınma prosesində çeşidlənməsində lipidlərin rolu hələ cavablandırılmamış uzun müddətdir davam edən əsas sualdır. Burada, çox uzun keramid lipid hissələri olan yeni sintez edilmiş qlikosilfosfatidilinozitol-immobilizasiya olunmuş zülalların klasterləşdiyini və transmembran zülalları tərəfindən istifadə ediləndən fərqli olan ixtisaslaşmış endoplazmaların Xalis çıxış yerinə təsnif edildiyini in vivo sübut etmək üçün 3D eyni vaxtda çoxrəngli yüksək qətnaməli real vaxt görüntüləmə aparırıq. Bundan əlavə, endoplazmatik retikulum membranındakı keramidin zəncir uzunluğunun bu çeşidləmə selektivliyi üçün vacib olduğunu göstəririk. Tədqiqatımız, lipid zəncirinin uzunluğuna əsaslanaraq sekretor yolda selektiv ixrac yerlərinə protein yüklərini təsnif etmək üçün ilk birbaşa in vivo dəlil təqdim edir.
Ökaryotik hüceyrələrdə endoplazmatik retikulumda (ER) sintez edilən zülallar daha sonra sekretor yoldan keçərək müvafiq hüceyrə təyinat yerlərinə çatdırılma zamanı çeşidlənir (1). Qabıq vasitəçiliyi ilə çeşidlənməyə əlavə olaraq, müəyyən lipidlərin müəyyən zülalların müəyyən membran domenlərinə qruplaşdıraraq selektiv çıxış nöqtələri kimi də xidmət edə biləcəyi uzun müddətdir fərz edilirdi (2-5). Bununla belə, bu mümkün lipid əsaslı mexanizmi sübut etmək üçün hələ də birbaşa in vivo dəlil yoxdur. Bu əsas problemi həll etmək üçün maya üzərində qlikosilfosfatidilinozitol (GPI) lövbərlənmiş zülalların (GPI-AP) ER-dən necə fərqli şəkildə ixrac edildiyini araşdırdıq. GPI-AP-lar lipidlə əlaqəli hüceyrə səthi zülallarının müxtəlifliyidir (6, 7). GPI-AP, qlikolipid hissəsi (GPI lövbəri) vasitəsilə plazma membranının xarici vərəqlərinə bağlanmış ifraz olunan bir zülaldır. Onlar GPI lövbərlərini ER lümenində mühafizəkar post-translyasiya modifikasiyaları kimi qəbul edirlər (8). Birləşdirildikdən sonra, GPI-AP Golgi aparatından (5, 9) ER-dən plazma membranına keçir. GPI lövbərlərinin olması GPI-AP-ın sekretor yol boyunca transmembran ifraz olunan zülallardan (digər plazma membran zülalları da daxil olmaqla) ayrıca daşınmasına səbəb olur (5, 9, 10). Maya hüceyrələrində GPI-AP-lar endoplazmatik retikulumda digər ifraz olunan zülallardan ayrılır və sonra örtük protein kompleksi II (COPII) ilə bükülmüş unikal veziküllərə qablaşdırılır (6, 7). ER ixrac prosesində bu təsnifat prosesinin determinantları aydın deyil, lakin bu mexanizmin lipidləri, xüsusən də GPI lövbərinin lipid hissəsinin struktur yenidən qurulmasını tələb edə biləcəyi ehtimal edilir (5, 8). Mayalarda GPI lipid yenidən qurulması GPI birləşdikdən dərhal sonra başlayır və bir çox hallarda seramidin 26 karbonlu uzun zəncirli doymuş yağ turşusuna (C26:0) bağlanmasına səbəb olur (11, 12). C26 keramid maya hüceyrələri tərəfindən indiyə qədər istehsal olunan əsas keramiddir. O, ER-də sintez olunur və əksəriyyəti COPII vezikülləri vasitəsilə Qolci aparatına ixrac olunur (13). GPI-AP-ın ER ixracı xüsusilə davamlı keramid sintezini tələb edir (14, 15) və öz növbəsində, Qolci aparatında keramidin inozitol fosfat keramidə (IPC) çevrilməsi GPI lövbər sintezindən asılıdır (16). Süni membranlarla aparılan biofiziki tədqiqatlar göstərib ki, çox uzun asil zəncirli keramidlər unikal fiziki xüsusiyyətlərə malik nizamlı domenlər yaratmaq üçün birləşə bilər (17, 18). Bu məlumatlar C26 keramid və C26 keramid ilə GPI-AP-ın nisbətən qarışıq ER membran lipid mühitində nizamlı bölgələrə və ya bölgələrə birləşməsi üçün fiziki xüsusiyyətlərindən istifadə etdiyi fərziyyəsinə gətirib çıxarır. Əsasən qısa və doymamış qliserolipidlərdən (C16:1 və C18:1) ibarətdir (19, 20). Bu bölgələr seçmə şəkildə xüsusi ER çıxış sahələrinə (ERES) yönəldiləcək, burada seramid və seramid əsaslı GPI-AP eyni xüsusi COPII vezikülündə Golgiyə birgə nəql edilə bilər (5).
Bu tədqiqatda, flüoresan etiketli zülalları eyni vaxtda müşahidə edə bilən qabaqcıl mikroskopiya texnikası olan super qətnaməli konfokal real vaxt görüntüləmə mikroskopiyasından (SCLIM) istifadə edərək bu lipid əsaslı mexanizmi birbaşa sınaqdan keçirdik. Üç rəngli və üçölçülü (3D) şəkillər canlı hüceyrələrdə son dərəcə yüksək qətnaməyə və sürətə malikdir (21, 22).
S. cerevisiae-də ER-dən çıxdıqdan sonra transmembran ifraz olunan zülallardan C26 keramid qrupu olan normal GPI-AP-ın necə yoxlanıldığını daha da müəyyən etmək üçün əvvəlcə SCLIM texnologiyasını tətbiq etdik. ER-in təsnifatını yoxlamaq üçün in vivo ERES-ə daxil olan yeni sintez olunmuş yükü birbaşa görüntüləyə bilən bir genetik sistemdən istifadə etdik (7, 23). Yük olaraq, hər ikisi plazma membranını hədəf alan yaşıl flüoresan zülal (GFP) ilə etiketlənmiş C26 keramid əsaslı GPI-AP Gas1 və yaxın infraqırmızı flüoresan zülal (iRFP) ilə etiketlənmiş transmembran ifraz olunmuş Mid2 zülalını seçdik (24-26). sec31-1 temperatur həssas mutantında bu iki yük qalaktoza induksiya edilə bilən promotor və tərkibli ERES markerinin altında ifadə olunur. Həddindən artıq temperaturda (37°C), sec31-1 mutasiyası COPII örtük komponenti Sec31-in COPII cücərməsini və ER ixracını maneə törətmək funksiyasına təsir etdiyindən, yeni sintez olunmuş yük ER-də toplanır (23). Aşağı temperatura (24°C) qədər soyuduqdan sonra, sec31-1 mutant hüceyrələri sekretor sahədən bərpa olundu və yığılmış yeni sintetik yük ER-dən ixrac olunmağa başladı. CLIM vizuallaşdırması göstərdi ki, yeni sintez edilmiş Gas1-GFP və Mid2-iRFP-nin əksəriyyəti 37°C-də inkubasiyadan sonra və sonra 24°C-də 5 dəqiqə ərzində buraxıldıqdan sonra sec31-1 mutant hüceyrələrinin ER-də hələ də toplanır (Şəkil 1). Mid2-iRFP bütün ER membranında paylandığından və Gas1-GFP kəsilməz ER membran sahəsində cəmləşdiyindən və toplandığından, onların paylanması tamamilə fərqlidir (Şəkil 1, A-dan C-yə və Film S1). Bundan əlavə, Şəkil 1D-də göstərildiyi kimi, Gas1-GFP klasterində Mid2-iRFP yoxdur. Bu nəticələr göstərir ki, GPI-AP və transmembran zülalları erkən dövrdə müxtəlif ER membran bölgələrinə ayrılıb. Gas1-GFP klasteri, mCherry-nin COPII örtük zülalı Sec13 (Şəkil 1, E və F və S1 filmi) ilə işarələnmiş spesifik ERES-ə bitişikdir (23).
sec31-1 hüceyrələri qalaktoza ilə induksiya olunmuş sekresiyaları ifadə edir, uzun asil zənciri (C26) seramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, yaşıl) və transmembran zülalı Mid2-iRFP (TMP, mavi) və bu Konstruktiv ERES etiketləmə Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edildi, 24°C-yə köçürüldü və 5 dəqiqə sonra SCLIM tərəfindən görüntüləndi. (A-dan C-yə) müstəvinin nümayəndəli birləşdirilmiş və ya tək 2D görüntüsünü (A), 10 z-bölmənin 2D proyeksiya görüntüsünü (B) və ya yükün və ERES markerlərinin 3D hüceyrə yarımkürə görüntüsünü (C) göstərir. Ölçü çubuğu 1μm (A və B). Ölçü vahidi 0.551μm-dir (C). Gas1-GFP diskret ER bölgələrində və ya klasterlərində aşkar edildi, Mid2-iRFP isə ER membranı boyunca aşkar edildi və paylandı (C). (D) Qrafik, ağ ox xətti (solda) boyunca Gas1-GFP klasterində Gas1-GFP və Mid2-iRFP-nin nisbi flüoresans intensivliyini göstərir. AU, ixtiyari vahid. (E və F) malları və ERES işarəsini birləşdirən 3D təsviri təmsil edir. Gas1-GFP klasterləri xüsusi ERES yaxınlığında aşkar edilmişdir. Ölçü vahidi 0,551μm-dir. (F) Ağ bütöv ox ERES ilə əlaqəli Gas1-GFP klasterini işarələyir. Orta və sağ panellər birləşdirilmiş böyüdülmüş 3D təsviri və seçilmiş Gas1-GFP klasterinin fırlanan görünüşünü göstərir.
Gas1-GFP klasteri ilə müəyyən bir ERES arasındakı sıx məkan əlaqəsi, Gas1-GFP-nin selektiv ERES-ə daxil ola biləcəyini göstərir ki, bu da Mid2-iRFP-nin ER-dən çıxmaq üçün istifadə etdiyi selektivlikdən fərqlidir. Bu ehtimalı aradan qaldırmaq üçün ERES nisbətini yalnız bir və ya iki mal üçün ölçdük (Şəkil 2, A-dan C-yə). Əksər ERES-lərin (70%) yalnız bir növ yük ehtiva etdiyini aşkar etdik. Şəkil 2C-nin alt təsvirində yalnız Gas1-GFP (Şəkil 1) və ya yalnız Mid2-iRFP (Şəkil 2) olan ERES-in iki tipik nümunəsi göstərilir. Bunun əksinə olaraq, ERES-in təxminən 20%-i eyni ərazidə üst-üstə düşən iki yük ehtiva edir. Bəzi ERES-lərin (10%) iki növ yük ehtiva etdiyi, lakin onlar açıq-aydın fərqli ərazilərdə təcrid olunduğu aşkar edilmişdir. Buna görə də, bu statistik təhlil göstərir ki, ER ixrac edildikdən sonra GPI-AP Gas1-GFP və transmembran yükü Mid2-iRFP fərqli ERES-lərə bölünür (Şəkil 2D). Bu çeşidləmə səmərəliliyi əvvəlki biokimyəvi analiz (6) və morfoloji təyinat (7) ilə çox uyğundur. ERES-ə daxil olan karantin altındakı yükün davranışını da müşahidə edə bilərik (Şəkil 2E və Film S2). Şəkil 2E göstərir ki, Gas1-GFP (panel 3) və ya Mid2-iRFP (panel 4)-ün yalnız kiçik bir hissəsi ERES-ə bir tərəfdən daxil olur və ayrı bir sahədə məhdudlaşır. Şəkil 2E-nin 5-ci paneli göstərir ki, Gas1-GFP və Mid2-iRFP bəzən eyni ERES-də olur, lakin onlar fərqli tərəflərdən daxil olur və fərqli COPII veziküllərini təmsil edə biləcək ayrı bölgələrdə cəmləşirlər. Həmçinin təsdiq etdik ki, müşahidə edilən C26 keramid əsaslı GPI-AP Gas1-in selektiv ERES kimi ayrılması və təsnifatı spesifikdir, çünki başqa bir transmembran sekresiya yükü, GFP ilə etiketlənmiş plazma membran zülalı Axl2 (27) Mid2-iRFP-yə oxşar davranış göstərir. (Şəkil S1 və Film S3). Yeni sintez edilmiş Axl2-GFP, ER membranı vasitəsilə Mid2-iRFP kimi paylanır (Şəkil S1, A və B) və əksər ERES-lərdə Mid2-iRFP ilə birgə lokallaşdırılır (Şəkil S1, B-dən D-yə). Şəkil 1-in 1 və 2-ci panelləri. S1C, iki transmembran yükünün üst-üstə düşdüyü ERES-in iki tipik nümunəsini göstərir. Bu hallarda, hər iki mal birlikdə ERES-ə daxil olur (Şəkil S1E, Panel 3 və Film S3).
Qalaktoza induksiya edilə bilən sekresiyaları ifadə edən sec31-1 hüceyrələri, Gas1-GFP (GPI-AP, yaşıl) və Mid2-iRFP (TMP, mavi) və Sec13-mCherry (ERES, magenta) tərkibli ERES etiketləmə hüceyrələri 37°C-də yerləşdirildi. 30 dəqiqə °C-də inkubasiya etdikdən sonra sekresiya blokunu buraxmaq üçün 24°C-yə keçin və 20 dəqiqədən sonra SCLIM ilə görüntüləyin. (A-dan C-yə) Yükün və ERES ilə işarələnmiş 10 z-bölmənin nümayəndəli 2D proyeksiya şəkilləri (A; miqyas zolağı, 1μm) və ya 3D hüceyrə yarımkürə şəkilləri (B və C; miqyas vahidi, 0.456μm). (B)-dəki aşağı panel və (C)-dəki panel yalnız ERES-də mövcud olan məhsulları (magenta) göstərmək üçün işlənmiş şəkilləri göstərir [Gas1-GFP (boz) və Mid2-iRFP (açıq mavi)]. (C) Açıq ox: ERES yalnız bir yük parçası daşıyır (1-dən 4-ə qədər). Boz ox: ERES ayrılmış yük ehtiva edir (5). Ağ bütöv ox: birlikdə yerləşdirilmiş yük ehtiva edən ERES. Aşağıda: Seçilmiş tək ERES yalnız Gas1-GFP (1) və ya Mid2-iRFP (2) ehtiva edir. Ölçü zolağı, 100 nm. (D) (C)-də təsvir edilən fotomikroqrafın kəmiyyətləndirilməsi. Yalnız bir yük (Gas1-GFP və ya Mid2-iRFP), ayrılmış yük və üst-üstə düşən yük ehtiva edən ERES-in orta faizi. Üç müstəqil təcrübədə 54 xanada n=432. Xəta zolağı = SD. İki quyruqlu qoşalaşmamış t testi. *** P = 0.0002. (E) (C) ilə işarələnmiş karantin altındakı yükün seçilmiş ERES-inin 3D təsviri. Gas1-GFP (yaşıl) (3) və ya Mid2-iRFP (mavi) (4) bir tərəfdən ERES-ə (bənövşəyi) daxil olur və ERES daxilində kiçik bir sahə ilə məhdudlaşdırılır. Bəzən hər iki növ yük eyni ERES-ə (5) eyni tərəfdən daxil olur və ERES daxilində təcrid olunmuş bir ərazi ilə məhdudlaşır. Miqyas zolağı, 100 nm.
Daha sonra, ER membranında mövcud olan uzun asil zəncirli keramidin (C26) Gas1-in spesifik klasterləşməsini və selektiv ERES-ə çevrilməsini təmin etdiyinə dair bir fərziyyəni sınaqdan keçirdik. Bu məqsədlə, iki endogen keramid sintazı olan Lag1 və Lac1-in GhLag1 (pambığın Lag1 homoloqu) ilə əvəz olunduğu modifikasiya olunmuş maya ştammı GhLag1-dən istifadə etdik və nəticədə hüceyrə membranı olan vəhşi tipdən daha qısa Seramid ştammı olan maya ştammı yarandı (Şəkil 3A) (28). Kütlə spektrometriyası (MS) təhlili göstərdi ki, vəhşi tipli ştammlarda ümumi keramidin 95%-i çox uzun (C26) zəncirli keramiddir, GhLag1-də isə keramidin 85%-i çox uzun (C18 və C16). ), keramidin yalnız 2%-i çox uzun (C26) zəncirli keramiddir. C18 və C16 keramidləri indiyə qədər GhLag1 membranında aşkar edilən əsas keramidlər olsa da, MS analizi həmçinin GhLag1 ştammında ifadə edilən Gas1-GFP-nin GPI lövbərinin vəhşi tip lipidlərlə müqayisə edilə bilən C26 keramid ehtiva etdiyini təsdiqlədi. Keyfiyyəti eynidir (Şəkil 3A) (26). Buna görə də, bu o deməkdir ki, keramid remodelinq fermenti Cwh43 C26 keramid üçün yüksək selektivdir, Şəkil 26-da göstərildiyi kimi, o, üstünlüklə GhLag1 ştammında az miqdarda C26 keramiddən GPI lövbərini özündə birləşdirir. S2 (29). Buna baxmayaraq, GhLag1-in hüceyrə membranı əsasən yalnız C18-C16 keramid ehtiva edir, Gas1-GFP isə hələ də C26 keramid ehtiva edir. Bu fakt bu ştammı ER-də membran keramidinin asil zəncir uzunluğu problemini xüsusi olaraq həll etmək üçün ideal bir vasitəyə çevirir. Sinif və çeşidləmənin hipotetik rolu. Daha sonra, əvvəlcə ənənəvi flüoresan mikroskopiya vasitəsilə C26 Gas1-GFP-nin temperatura həssas mutant alleli sec31-1 ilə GhLag1-də klasterlərdə toplanma qabiliyyətini araşdırdıq, burada yalnız uzun (C18-C16) zəncir ER membranı Ceramiddə mövcuddur (Şəkil 3). Müşahidə etdik ki, sec31-1-də Gas1-GFP-nin əksəriyyəti klasterlərdə cəmləşib, uzun (C18-C16) uzun keramid ER membranı olan sec31-1 GhLag1-də Gas1-GFP isə əsasən klasterləşməyib və bütün ER membranında paylanmayıb. Dəqiq desək, C26 keramid əsaslı klasterləşmə spesifik ERES ilə sıx əlaqəli olduğundan (Şəkil 1), daha sonra bu prosesin ER ixrac zülal mexanizminin funksiyasını da əhatə edə biləcəyini araşdırdıq. GPI-AP, ER ixracı üçün xüsusi COPII sistemindən istifadə edir ki, bu da GPI lövbərinin qlikan hissəsinin Ted1-in struktur yenidən qurulması ilə aktiv şəkildə tənzimlənir (30, 31). Rekombinant GPI-qlikan daha sonra transmembran yük reseptoru p24 kompleksi tərəfindən tanınır və bu da öz növbəsində əsas COPII yük birləşdirici alt vahidi Sec24-ün spesifik izoformu olan Lst1-i selektiv şəkildə işə götürür və GPI-AP ilə zəngin COPII Vezikülləri əmələ gətirir (31-33). Buna görə də, bu tək zülalların (p24 kompleks komponenti Emp24, GPI-qlikan remodeling fermenti Ted1 və spesifik COPII alt vahidi Lst1) silinməsini sec31-1 mutant ştammı ilə birləşdirən ikiqat mutant qurduq və onları araşdırdıq. Gas1-klaster GFP yaratmaq mümkündürmü (Şəkil 3). Müşahidə etdik ki, sec31-1emp24Δ və sec31-1ted1Δ-də Gas1-GFP əsasən qruplaşdırılmamış və ER membranı boyunca paylanmışdır, əvvəllər sec31-1 GhLag1-də görüldüyü kimi, sec31-1lst1Δ-də isə Gas1-GFP sec31-1 kimidir. Bu nəticələr göstərir ki, ER membranında C26 keramidinin olmasına əlavə olaraq, Gas1-GFP-nin klasterləşməsi də p24 kompleksinə bağlanmalıdır və xüsusi Lst1 cəlb edilməsini tələb etmir. Daha sonra, ER membranındakı keramidin zəncir uzunluğunun Gas1-GFP-nin p24-ə bağlanmasını tənzimləyə bilməsi ehtimalını araşdırdıq. Lakin, membranda C18-C16 keramidin olması p24 kompleksi tərəfindən bərpa edilən GPI-qlikanlara (Şəkillər S3 və S4, A və B) və ya GPI-AP-a bağlanma və GPI-AP ixrac etmə qabiliyyətinə təsir etmir. COPII alt tipi Lst1-i işə götürün (Şəkil S4C). Buna görə də, C26 keramiddən asılı klasterləşmə müxtəlif ER ixrac protein mexanizmləri ilə zülal qarşılıqlı təsirini tələb etmir, lakin lipid uzunluğu ilə idarə olunan alternativ çeşidləmə mexanizmini dəstəkləyir. Daha sonra, ER membranındakı keramid asil zəncir uzunluğunun Gas1-GFP-nin selektiv ERES kimi effektiv təsnifatı üçün vacib olub-olmadığını təhlil etdik. Qısa zəncirli keramid ilə GhLag1 ştammındakı Gas1 ER-dən çıxıb plazma membranına daxil olduğundan (Şəkil S5), çeşidləmə keramid asil zəncirinin uzunluğu ilə idarə olunarsa, GhLag1 ştammındakı Gas1-in yönləndirilə və çarpazlaşa biləcəyinə inanırıq. Eyni membrana malik ERES malları.
(A) GhLag1 hüceyrə membranı əsasən daha qısa C18-C16 keramidlərindən ibarətdir, Gas1-GFP-nin GPI lövbəri isə hələ də vəhşi tip hüceyrələrlə eyni C26 IPC-yə malikdir. Yuxarıda: kütləvi spektrometriya (MS) ilə vəhşi tip (Wt) və GhLag1p ştammlarının hüceyrə membranında keramidin asil zəncir uzunluğu təhlili. Məlumatlar ümumi keramidin faizini təmsil edir. Üç müstəqil təcrübənin ortalaması. Xəta zolağı = SD. İki quyruqlu qoşalaşmamış t testi. **** P <0.0001. Alt panel: vəhşi tip və GhLag1p ştammlarında ifadə edilən Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI lövbərində mövcud olan IPC-nin asil zəncir uzunluğunun MS təhlili. Məlumatlar ümumi IPC siqnalının faizini təmsil edir. Beş müstəqil təcrübənin ortalaması. Xəta zolağı = SD. İki quyruqlu qoşalaşmamış t testi. ns, vacib deyil. P = 0.9134. (B) Qalaktoza ilə induksiya olunmuş Gas1-GFP ifadə edən sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ və sec31-1lst1Δ hüceyrələrinin flüoresan mikroqrafları 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edildi və 24°C-dən sonra rutin flüoresan mikroskopiyası aparıldı. Ağ ox: ER Gas1-GFP klasteri. Açıq ox: Klasterləşdirilməmiş Gas1-GFP bütün ER membranında paylanmışdır və ER-in xarakterik nüvə halqası boyanmasını göstərir. Miqyas zolağı, 5μm. (C) (B)-də təsvir edilən fotomikroqrafın kəmiyyətləndirilməsi. Nöqtəli Gas1-GFP strukturuna malik hüceyrələrin orta faizi. Üç müstəqil təcrübədə n≥300 hüceyrə. Xəta zolağı = SD. İki quyruqlu qoşalaşmamış t testi. **** P <0.0001.
Bu problemi birbaşa həll etmək üçün GhLag1-də sec31-1 temperatur həssas mutant alleli ilə Gas1-GFP və Mid2-iRFP-nin SCLIM vizualizasiyasını apardıq (Şəkil 4 və Film S4). ER 37°C-də saxlanıldıqdan və sonradan 24°C-də buraxıldıqdan sonra, yeni sintez edilmiş Gas1-GFP-nin əksəriyyəti ənənəvi mikroskoplarla müşahidə edildiyi kimi ER membranı boyunca qruplaşdırılmamış və paylanmamışdır (Şəkil 4, A və B). Bundan əlavə, ERES-in böyük bir faizi (67%) onun içərisində birlikdə yerləşən iki növ yükü ehtiva edir (Şəkil 4D). Şəkil 4C-nin 1 və 2-ci panelləri Gas1-GFP və Mid2-GFP-nin üst-üstə düşdüyü iki tipik ERES nümunəsini göstərir. Bundan əlavə, hər iki məhsul eyni ERES-ə cəlb edilmişdir (Şəkil 4E, panel 3 və film S4). Buna görə də, nəticələrimiz göstərir ki, ER membranındakı seramid asil zəncirinin uzunluğu ER zülalının aqreqasiyası və təsnifatının vacib bir determinantıdır.
Sec31-1 Qalaktoza ilə induksiya olunmuş sekresiyaları ifadə edən GhLag1 hüceyrələri, Gas1-GFP (GPI-AP, yaşıl) və Mid2-iRFP (TMP, mavi) və ERES ilə işarələnmiş Sec13-mAlbalı (ERES, magenta). 37°C-də inkubasiya edin. 30 dəqiqə davam edin, sekresiyaları buraxmaq üçün 24°C-yə endirin və 20 dəqiqədən sonra SCLIM ilə görüntüləyin. (A-dan C-yə) Yük və ERES ilə işarələnmiş 10 z-bölmənin nümayəndəli 2D proyeksiya şəkilləri (A; miqyas zolağı, 1μm) və ya 3D hüceyrə yarımkürə şəkilləri (B və C; miqyas vahidi, 0.45μm). (B)-dəki aşağı panel və (C)-dəki panel yalnız ERES-də mövcud olan malları (magenta) göstərmək üçün işlənmiş şəkilləri göstərir [Gas1-GFP (boz) və Mid2-iRFP (açıq mavi)]. (C) Ağ doldurulmuş ox: ERES, mallar üst-üstə düşür. Açıq ox: ERES yalnız bir element ehtiva edir. Aşağı panel: Seçilmiş ERES-də (C) ilə işarələnmiş üst-üstə düşən mallar (1 və 2) var. Ölçü zolağı, 100 nm. (D) (C) ilə təsvir edilmiş fotomikroqrafın kəmiyyətləndirilməsi. 31-1-ci və 31-1-ci GhLag1 bölmələrində yalnız bir yük (Gas1-GFP və ya Mid2-iRFP) və təcrid olunmuş yük və üst-üstə düşən yük üçün ERES-in orta faizi daxil edilmişdir. Üç müstəqil təcrübədə 54 hücrədə n = 432 (31-1-ci hissə) və 47 hücrədə n = 430 (31-1-ci hissə GhLag1). Xəta zolağı = SD. İki quyruqlu qoşalaşmamış t testi. *** P = 0.0002 (31-1-ci hissə) və ** P = 0.0031 (31-1-ci hissə GhLag1). (E) (C) ilə işarələnmiş üst-üstə düşən yük (3) ilə seçilmiş ERES-in 3D təsviri. Gas1-GFP (yaşıl) və Mid2-iRFP (mavi) eyni tərəfdən ERES-ə (bənövşəyi) yaxınlaşır və eyni ERES məhdudlaşdırılmış ərazisində qalır. Miqyas zolağı, 100 nm.
Bu tədqiqat, lipid əsaslı zülal yüklərinin sekretor yolda selektiv ixrac sahələrinə təsnif edildiyinə dair birbaşa in vivo sübutlar təqdim edir və təsnifat selektivliyi üçün asil zəncir uzunluğunun əhəmiyyətini ortaya qoyur. SCLIM adlı güclü və qabaqcıl mikroskopiya texnikasından istifadə edərək, maya tərkibində yeni sintez edilmiş Gas1-GFP-ni (çox uzun asil zənciri (C26) keramid lipid hissəsinə malik əsas plazma membranı GPI-AP) nümayiş etdirdik. Diskret ER-lərdə toplanmış bölgələr spesifik ERES ilə əlaqələndirilir, transmembran ifraz olunan zülallar isə ER membranı boyunca paylanır (Şəkil 1). Bundan əlavə, bu iki növ mal selektiv olaraq fərqli ERES-lərə daxil olur (Şəkil 2). Membrandakı hüceyrə keramidin asil zəncir uzunluğu C26-dan C18-C16-ya qədər azalır, Gas1-GFP klasteri diskret ER bölgəsinə parçalanır və Gas1-GFP eyni ERES vasitəsilə transmembran zülalı ilə ER-i tərk etmək üçün yenidən yönləndirilir (Şəkil 3 və Şəkil 3). 4).
GPI-AP ER-dən çıxmaq üçün ixtisaslaşmış bir protein mexanizmindən istifadə etsə də, C26 keramiddən asılı ayrılmanın ERES ixtisaslaşmasına səbəb ola biləcək diferensial protein qarşılıqlı təsirlərindən asılı olmadığını aşkar etdik (Şəkillər S4 və S5). Bunun əvəzinə, tapıntılarımız lipid əsaslı protein klasterləşməsi və sonradan digər yüklərin xaric edilməsi ilə idarə olunan alternativ bir təsnifat mexanizmini dəstəkləyir. Müşahidələrimiz göstərir ki, müəyyən bir ERES ilə əlaqəli Gas1-GFP bölgəsi və ya klasterində transmembran ifraz olunan zülal Mid2-iRFP yoxdur, bu da C26 keramiddən asılı GPI-AP klasterinin onların müvafiq ERES-ə daxil olmasını asanlaşdıracağını və eyni zamanda transmembranı xaric edəcəyini göstərir. Sekresiyalar bu xüsusi ERES-ə daxil olur (Şəkillər 1 və 2). Əksinə, ER membranında C18-C16 keramidlərinin olması GPI-AP-ın bölgələr və ya klasterlər yaratmasına səbəb olmur, buna görə də onlar transmembran ifraz olunan zülalları eyni ERES-ə xaric etmir və ya əvəz etmir (Şəkillər 3 və 4). Buna görə də, C26 seramidin spesifik ERES ilə əlaqəli zülalların klasterləşməsini asanlaşdıraraq ayrılma və təsnifatı idarə etdiyini təklif edirik.
Bu C26 keramiddən asılı klasterləşməni müəyyən bir ER sahəsinə necə nail olmaq olar? Membran keramidinin yan tərəfə ayrılma meyli, daha qısa və doymamış qliserolipidlər ehtiva edən ER membranının daha nizamsız lipid mühitində GPI-AP və C26 keramidinin kiçik və ani şəkildə düzülmüş lipidlər əmələ gətirməsinə səbəb ola bilər. Keyfiyyət klasterləri (17, 18). Bu kiçik müvəqqəti klasterlər p24 kompleksinə bağlandıqdan sonra daha böyük, daha sabit klasterlərə birləşdirilə bilər (34). Buna uyğun olaraq, biz C26 Gas1-GFP-nin daha böyük görünən klasterlər yaratmaq üçün p24 kompleksi ilə qarşılıqlı təsir göstərməli olduğunu göstərdik (Şəkil 3). p24 kompleksi, mayadakı dörd fərqli p24 transmembran zülalından ibarət heterozigot oliqomerdir (35), bu da çoxvalentli bağlanma təmin edir ki, bu da kiçik GPI-AP klasterlərinin çarpaz bağlanmasına səbəb ola bilər və bununla da daha böyük Sabit klaster yaradır (34). GPI-AP-ların zülal ektodomenləri arasındakı qarşılıqlı təsir, məməlilərin polyarlaşmış epitel hüceyrələrində Golgi daşınması zamanı göründüyü kimi, onların aqreqasiyasına da töhfə verə bilər (36). Lakin, ER membranında C18-C16 keramidi olduqda, p24 kompleksi Gas1-GFP-yə bağlandıqda, böyük ayrı klasterlər əmələ gəlməyəcəkdir. Əsas mexanizm uzun asil zəncirli keramidin spesifik fiziki və kimyəvi xüsusiyyətlərindən asılı ola bilər. Süni membranların biofiziki tədqiqatları göstərir ki, həm uzun (C24), həm də qısa (C18-C16) asil zəncirli keramidlər faza ayrılmasına səbəb ola bilsə də, yalnız uzun asil zəncirli keramidlər (C24) yüksək əyriliyi və film əyilməsini təşviq edərək filmi yenidən formalaşdıra bilər. Qarşılıqlı istinad yolu ilə (17, 37, 38). Emp24-ün insan homologu olan TMED2-nin transmembran spiralının sitoplazmatik lobullarda C18 keramid əsaslı sfinqomielin ilə selektiv şəkildə qarşılıqlı təsir göstərdiyi göstərilmişdir (39). Molekulyar dinamika (MD) simulyasiyalarından istifadə edərək, həm C18, həm də C26 keramidlərinin Emp24 transmembran spiralının sitoplazmatik lobulları ətrafında toplandığını və oxşar üstünlüklərə malik olduqlarını aşkar etdik (Şəkil S6). Qeyd etmək lazımdır ki, bu, Emp24-ün transmembran spiralının membranda lipidlərin asimmetrik paylanmasına səbəb ola biləcəyini göstərir. Bu, məməli hüceyrələrinə əsaslanan son nəticədir. Oxşar MD simulyasiyaları da efir lipidlərinin mövcudluğunu göstərir (40). Buna görə də, ER26-nın iki lobulundakı C26 keramidinin lokal olaraq zənginləşdiyini fərz edirik. Luminal lobullarda GPI-AP birbaşa çoxvalentli p24-ə bağlandıqda və sitoplazmatik lobullarda p24 ətrafında C26 keramidinin toplanmasında, müşayiət olunan zülal aqreqasiyasını və membran əyriliyinin barmaqlar vasitəsilə əmələ gəlməsini təşviq edə bilər (41), bu da GPI-AP-nın ERES-ə bitişik ayrı-ayrı bölgələrə ayrılmasına səbəb olur ki, bu da ER membranının yüksək əyri bölgələrinə üstünlük verir (42). Əvvəlki hesabatlar təklif olunan mexanizmi dəstəkləyirdi (43, 44). Plazma membranında oliqolektinlərin, patogenlərin və ya antikorların seramid əsaslı qlikosfinqolipidlərə (GSL) çoxvalentli bağlanması böyük GSL aqreqasiyasını tetikler, faza ayrılmasını gücləndirir və membran deformasiyasına və daxililəşməsinə səbəb olur (44). İvabuçi və s. (43) Uzun (C24), lakin qısa (C16) olmayan asil zəncirlərinin mövcudluğunda, GSL laktosilseramidə bağlı çoxvalentli ligandın böyük klasterlərin əmələ gəlməsinə və membran invaginasiyasına səbəb olduğu və sitoplazmanın Lyn vasitəçiliyi ilə vərəqələrdə siqnal ötürülməsinin birləşmiş neytrofillərdə asil zəncirləri ilə birləşdiyi aşkar edilmişdir.
Məməlilərin polyarlaşmış epitel hüceyrələrində anti-Qolci şəbəkəsinin (TGN) apikal plazma membranı səviyyəsinə konsentrasiyası GPI-AP-ın ayrılmasını və çeşidlənməsini idarə edir (10, 45). Bu aqreqasiya GPI-AP oliqomerləşməsi ilə idarə olunur (36), lakin bu, həmçinin maya göbələklərində rast gəldiyimiz keramid zəncirinin uzunluğundan da asılı ola bilər. Məməlilərin GPI-AP-ı efir lipid əsaslı lövbərə malik olsa da və kimyəvi quruluşu çox uzun asil zəncirli keramiddən çox fərqli olsa da, son tədqiqatlar hər iki lipidin təkamül baxımından oxşar fiziki və kimyəvi xüsusiyyətlərə və funksiyaya malik olduğunu aşkar etmişdir (40). Buna görə də, məməli hüceyrələrindəki efir lipid hissəsi maya göbələklərindəki C26 keramidinə bənzər ola bilər və onun rolu membrandakı uzun zəncirli keramidlə əlaqə quraraq GPI-AP aqreqasiyasını və çeşidlənməsini təşviq etməkdir. Bu ehtimalın hələ də birbaşa sınaqdan keçirilməsinə ehtiyac olsa da, əvvəlki tapıntılar uzun asil zəncirli keramidin Qolci gövdəsinə daşınmasının sitoplazmatik transfer zülalları tərəfindən deyil, maya kimi GPI lövbərlərinin sintezindən asılı olduğunu təsdiqləyir. Buna görə də, təkamül mühafizəkar mexanizmi çox uzun asil zəncirli keramidi və GPI-AP-ni (13, 16, 20, 46, 47) eyni nəqliyyat vezikülündə selektiv şəkildə birgə daşıya bilir.
Maya və məməlilərin polyarlaşmış epitel hüceyrə sistemlərində GPI-AP aqreqasiyası və digər plazma membran zülallarından ayrılması hüceyrə səthinə çatmazdan əvvəl baş verir. Paladino və digərləri (48) məməlilərin polyarlaşmış epitel hüceyrələrinin TGN-də GPI-AP klasterləşməsinin yalnız GPI-AP-ların apikal plazma membranına selektiv təsnifatı üçün deyil, həm də GPI-AP-ların klasterləşmə təşkilatını və onun bioloji aktivliyini tənzimlədiyini aşkar etdilər. Hüceyrə səthi. Mayalarda bu tədqiqat göstərdi ki, ER-dəki C26 keramiddən asılı GPI-AP klasteri plazma membranında GPI-AP-ın klasterləşmə təşkilatını və funksional fəaliyyətini tənzimləyə bilər (24, 49). Bu modelə uyğun olaraq, GhLag1 hüceyrələri GPI inhibitorlarına və ya hüceyrə divarının bütövlüyünə təsir edən dərmanlara allergiyadır (28) və maya hüceyrələrinin cütləşməsində proyeksiya olunan ucluq keramidin funksional Gas1-GFP klasterlərinə ehtiyac (49) G-ni göstərir. hLag1 hüceyrələrinin mümkün fizioloji nəticələri. GPI-AP xətası. Lakin, hüceyrə səthinin funksional təşkilinin lipid uzunluğuna əsaslanan çeşidləmə metodu ilə ER-dən proqramlaşdırılıb-proqramlaşdırılmadığını daha da yoxlamaq gələcək tədqiqatlarımızın mövzusu olacaq.
Bu işdə istifadə edilən Saccharomyces cerevisiae ştammları Cədvəl S1-də verilmişdir. Canlı hüceyrə görüntüləməsi üçün SCLIM-in MMY1583 və MMY1635 ştammları W303 fonunda qurulmuşdur. Sec13-mCherry-ni flüoresan zülal etiketi ilə ifadə edən bu ştammlar, pFA6a plazmidini şablon kimi istifadə edərək polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR) əsaslı metoddan istifadə etməklə qurulmuşdur (23). GAL1 promotorunun nəzarəti altında flüoresan zülal ilə etiketlənmiş Mid2-iRFP ifadə edən ştamm aşağıdakı kimi qurulmuşdur. pKTiRFP-KAN vektorundan iRFP-KanMx ardıcıllığının PCR amplifikasiyası (E. O'Shea hədiyyəsi, Addgene plazmid nömrəsi 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; tədqiqat resurs identifikatoru (RRID): Addgene_64687) Və endogen Mid2-nin C-terminalına daxil edilmişdir. Mid2-iRFP genom ardıcıllığı gücləndirildikdən və GAL1 promotoruna klonlaşdırıldıqdan sonra, pRS306 inteqrasiya plazmidinin Not I-Sac I saytına inteqrasiya edildi. Nəticədə yaranan pRGS7 plazmid URA3 lokusa inteqrasiya etmək üçün Pst I ilə xəttiləşdirildi.
Gas1-GFP birləşmə geni, aşağıdakı kimi qurulmuş sentromer (CEN) plazmidində GAL1 promotorunun nəzarəti altında ifadə olunur. Gas1-GFP ardıcıllığı, pRS416-GAS1-GFP plazmidindən (24) (L. Popolonun hədiyyəsi) PCR ilə gücləndirilmiş və CEN plazmidinin pBEVY-GL LEU2-nin (C-nin hədiyyəsi) Xma I–Xho I saytına klonlaşdırılmışdır. Miller; Addgene plazmid nömrəsi 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Nəticədə yaranan plazmid pRGS6 adlandırılmışdır. Axl2-GFP birləşmə geni də pBEVY-GL LEU2 vektorunun GAL1 promotorunun nəzarəti altında ifadə olunur və onun quruluşu aşağıdakı kimidir. Axl2-GFP ardıcıllığı pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmidindən (23) PCR ilə gücləndirilmiş və pBEVY-GL LEU2 vektorunun Bam HI-Pst I saytına klonlaşdırılmışdır. Nəticədə yaranan plazmid pRGS12 adlandırılmışdır. Bu tədqiqatda istifadə edilən oliqonukleotidlərin ardıcıllığı Cədvəl S2-də verilmişdir.
Qidalanma üçün tələb olunan müvafiq amin turşularını və əsasları tamamlamaq məqsədilə ştamm karbon mənbəyi kimi 0,2% adenin və 2% qlükoza [YP-dekstroza (YPD)], 2% rafinoz [YP-rafinoz] ilə zəngin maya ekstraktı zülalı p (YP) mühiti (1% Maya ekstraktı və 2% protein ept). (YPR)] və ya 2% qalaktoza [YP-qalaktoza (YPG)] ilə, yaxud sintetik minimal mühitdə (0,15% maya azot bazası və 0,5% ammonium sulfat) əlavə edilmişdir. Karbon mənbəyi kimi 2% qlükoza (sintetik qlükoza minimal mühiti) və ya 2% qalaktoza (sintetik qalaktoza minimal mühiti) ehtiva etmişdir.
Real vaxt görüntüləməsi üçün, GAL1 promotoru altında konstruksiyanı ifadə edən temperatur həssas sec31-1 mutant hüceyrələri YPR mühitində 24°C-də gecə orta loq fazasına qədər yetişdirildi. 24°C-də YPG-də 1 saat induksiya edildikdən sonra hüceyrələr 37°C-də SG-də 30 dəqiqə inkubasiya edildi və sonra sekresiya blokundan azad olmaq üçün 24°C-yə köçürüldü. Hüceyrələri şüşə slaydda fiksasiya etmək və SCLIM vasitəsilə görüntüləmək üçün Konkanavalin A istifadə edildi. SCLIM, Olympus IX-71 tərs flüoresan mikroskopu və UPlanSApo 100×1.4 ədədi diafraqmalı yağ linzasının (Olympus), yüksək sürətli və yüksək siqnal-səs-küy nisbətinə malik fırlanan disk konfokal skanerinin (Yokogawa Electric), xüsusi spektrometrin və xüsusi soyutmanın birləşməsidir. Sistemin görüntü gücləndiricisi (Hamamatsu Photonics) son böyütmə ×266.7 olan böyüdücü linza sistemi və elektronları vuran yüklə birləşdirilmiş cihaz kamerası (Hamamatsu Photonics) təmin edə bilər (21). Təsvirin əldə edilməsi xüsusi proqram təminatı (Yokogawa Electric) tərəfindən həyata keçirilir. 3D görüntülər üçün obyektiv linzanı şaquli olaraq titrətmək üçün xüsusi hazırlanmış pyezoelektrik aktuatordan istifadə etdik və optik hissələri 100 nm məsafədə bir yığında topladıq. Z-yığın görüntüsü 3D voksel məlumatlarına çevrilir və fırlanan disk konfokal mikroskopu üçün istifadə edilən nəzəri nöqtə yayılması funksiyası Volocity proqram təminatı (PerkinElmer) tərəfindən dekonvolusiya emalı üçün istifadə olunur. Volocity proqram təminatından istifadə edərək, yük daxil olmaqla ERES kolokasiya analizi üçün avtomatik olaraq ölçüldü. Xətt skan analizi MetaMorph proqram təminatı (Molecular Devices) istifadə edilərək aparıldı.
Statistik əhəmiyyəti müəyyən etmək üçün GraphPad Prism proqram təminatından istifadə edin. İki quyruqlu Tələbə t-testi və adi birtərəfli dispersiya təhlili (ANOVA) testi üçün qruplar arasındakı fərqlərin P <0.05 (*) üzərində əhəmiyyətli təsir göstərdiyi düşünülür.
Gas1-GFP-nin flüoresan mikroskopiyası üçün loqarifmik fazalı hüceyrələr YPD-də bir gecədə yetişdirilmiş və santrifüqləmə yolu ilə toplanmışdır, iki dəfə fosfat tamponlu salin məhlulu ilə yuyulmuş və ən azı 15 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edilmiş və sonra əvvəllər təsvir edildiyi kimi mikroskop altında davam etdirilmişdir. Yoxlama (24). Əldə etmək üçün obyektiv linza, L5 (GFP) filtri, Hamamatsu kamerası və Application Suite X (LAS X) proqram təminatı ilə təchiz olunmuş Leica DMi8 mikroskopu (HCX PL APO 1003/1.40 yağ PH3 CS) istifadə edilmişdir.
Nümunələr 65°C-də 10 dəqiqə ərzində SDS nümunə buferi ilə denaturasiya edildi və sonra SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (PAGE) ilə ayrıldı. İmmunoblotinq analizi üçün hər zolaq üçün 10 μl nümunə yükləndi. İlkin antikor: 1:3000 nisbətində durulaşdırılmış dovşan poliklonal anti-Gas1, 1:500 nisbətində durulaşdırılmış dovşan poliklonal anti-Emp24 və 1:3000 nisbətində durulaşdırılmış dovşan poliklonal anti-GFP (H. Riezmandan hədiyyə) istifadə edin. Siçan monoklonal anti-Pgk1 antikoru 1:5000 nisbətində durulaşdırılmış (J. de la Cruzdan hədiyyə) istifadə edildi. İkinci dərəcəli antikor: 1:3000 nisbətində durulaşdırılmış horseradish peroksidaza (HRP) ilə konjuge edilmiş keçi anti-dovşan immunoglobulini G (IgG) (Pierce) istifadə edildi. HRP ilə konjuge edilmiş keçi siçan əleyhinə IgG 1:3000 nisbətində durulaşdırılaraq istifadə edilmişdir (Pierce). İmmun cavab zonası SuperSignal West Pico reaktivinin (Thermo Fisher Scientific) xemilüminesensiya metodu ilə müşahidə edilmişdir.
(31)-də təsvir edildiyi kimi, zənginləşdirilmiş ER fraksiyası üzərində təbii immunpresipitasiya təcrübəsi aparılmışdır. Bir sözlə, maya hüceyrələrini 100 optik sıxlıqda 600 nm (OD600)-də iki dəfə TNE buferi [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil flüorid və proteaza inhibitor qarışığı) ilə yuyun. Şüşə muncuqlarla qırıldı və sonra hüceyrə qalıqları və şüşə muncuqlar santrifüqləmə yolu ilə təmizləndi. Daha sonra supernatant 17000 q-da 4°C-də 15 dəqiqə santrifüqləşdirildi. Qranul TNE-də yenidən suspenziya edildi və digitalis saponini 1% son konsentrasiyaya əlavə edildi. Süspansiyon 4°C-də fırlanma ilə 1 saat inkubasiya edildi və sonra həll olmayan komponentlər 13000 q-da 4°C-də 60 dəqiqə santrifüqləmə yolu ilə təmizləndi. Gas1-GFP immunpresipitasiyası üçün əvvəlcə nümunəni boş agaroza muncuqları (ChromoTek) ilə 4°C-də 1 saat əvvəlcədən inkubasiya edin, sonra isə 4°C-də 3 saat GFP-Trap_A (ChromoTek) ilə inkubasiya edin. İmmunpresipitasiya olunmuş muncuqlar 0,2% digoksigenin tərkibli TNE ilə beş dəfə yuyuldu, SDS nümunə buferi ilə elusiya edildi, SDS-PAGE-də ayrıldı və immunoblottinqlə təhlil edildi.
(31)-də təsvir edildiyi kimi, zənginləşdirilmiş ER fraksiyası üzərində çarpaz əlaqə təyini aparılmışdır. Qısaca desək, zənginləşdirilmiş ER fraksiyası 0,5 mM ditiobis (süksinimidil propionat) ilə inkubasiya edilmişdir (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, ABŞ; 20°C, 20 dəq). Çarpaz əlaqə reaksiyası qlisin əlavə etməklə söndürülmüşdür (50 mM son konsentrasiya, 5 dəqiqə, 20°C).
Əvvəllər təsvir edildiyi kimi (50), vəhşi tip və GhLag1 ştammlarında keramidin MS analizi aparılmışdır. Bir sözlə, hüceyrələr 30°C-də YPD-də eksponensial fazaya (3-4 OD600 vahid/ml) qədər böyüdülmüş və 25×107 hüceyrə toplanmışdır. Onların metabolizması trixlorsirkə turşusu ilə söndürülmüşdür. Ekstraksiya həlledicisindən [etanol, su, efir, piridin və 4.2 N ammonium hidroksid (15:15:5:1:0.018 v/v)] və 1.2 nmol daxili standart C17 keramidi (860517, Avanti polyar lipid) keyfiyyətli istifadə edin. Ekstraktın yüngül qələvi hidrolizini həyata keçirmək üçün monometilamin reagentindən [metanol, su, n-butanol və metilamin məhlulu (4:3:1:5 v/v)] istifadə edin və sonra duzsuzlaşdırmaq üçün su ilə doymuş n-butanoldan istifadə edin. Nəhayət, ekstrakt müsbət rejimli həlledicidə [xloroform/metanol/su (2:7:1) + 5 mM ammonium asetat] yenidən suspenziya edildi və kütlə spektrometrinə yeridildi. Sfingolipid molekullarının identifikasiyası və kəmiyyətləndirilməsi üçün çoxreaksiyalı monitorinq (MRM) aparıldı. TSQ Vantage üçüncü dərəcəli kvadrupol kütlə spektrometri (Thermo Fisher Scientific) lipid analizi üçün robot nanoflow ion mənbəyi Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ilə təchiz edilmişdir. Toqquşma enerjisi hər bir seramid kateqoriyası üçün optimallaşdırılıb. MS məlumatları müsbət rejimdə əldə edildi. Hər bir bioloji təkrarlama üçün lipid siqnalı üç müstəqil ölçmənin medianıdır.
(31)-də təsvir edildiyi kimi, Gas1-GFP ifadə edən hüceyrələr (800×107) təbii immunprecipitasiyaya məruz qaldı. Təmizlənmiş Gas1-GFP SDS-PAGE ilə ayrıldı və poliviniliden flüorid (PVDF) membranına köçürüldü. Zülal PVDF-ni amid qarası ilə boyamaqla vizuallaşdırıldı. Gas1-GFP zolağı PVDF-dən kəsildi və 5 dəfə metanol və bir dəfə maye xromatoqrafiya-MS (LC-MS) dərəcəli su ilə yuyuldu. Membran zolağı 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), bufer və 500μl təzə həll edilmiş 1 M natrium nitrit qarışığı ilə 37°C-də 3 saat inkubasiya edilərək lipid fraksiyası Gas1-GFP-dən azad olur və lizis edilir. Qlükozamin və inozitol arasında inozin fosfat seramidin sərbəst buraxılması (51). Bundan sonra, membran zolağı LC-MS dərəcəli su ilə dörd dəfə yuyuldu, otaq temperaturunda quruduldu və analiz olunana qədər -80°C-də azot atmosferində saxlanıldı. Nəzarət olaraq, hər təcrübə üçün PVDF membranının boş nümunəsi istifadə edildi. Gas1-GFP-dən çıxarılan lipid daha sonra (50) təsvir edildiyi kimi MS ilə təhlil edildi. Bir sözlə, GPI-lipid ehtiva edən PVDF zolaqları 75μl mənfi qəlib həlledicisində [xloroform/metanol (1:2) + 5 mM ammonium asetat] yenidən suspenziya edildi və sfingolipid növlərinin elektrosprey ionlaşması (ESI)-MRM/MS analizindən (TSQ Vantage) keçdi. Bu halda, MS məlumatları mənfi ion rejimində əldə edildi.
Daha əvvəl qeyd edildiyi kimi, GPI lövbərinin lipid hissəsi [3H]-inositol ilə işarələnmiş GPI-AP-dan (16) ayrılmışdır. Lipidlər həlledici sistemindən (55:45:10 xloroform-metanol-0,25% KCl) istifadə edərək nazik təbəqəli xromatoqrafiya ilə ayrılmış və FLA-7000 (Fujifilm) istifadə edərək vizuallaşdırılmışdır.
Gas1-GFP (600×107) ifadə edən hüceyrələr iki dəfə TNE buferli TNE buferi ilə yuyuldu və şüşə muncuqlarla qırıldı, sonra hüceyrə qalıqlarını və şüşə muncuqları təmizləmək üçün santrifüj edildi. Daha sonra supernatant 17000 q-da 4°C-də 1 saat ərzində santrifüj edildi. Qranul TNE-də yuyuldu və 37°C-də 1 saat ərzində 0,2% digitalis saponin tərkibli TNE-də 1 U PI-PLC (Invitrogen) ilə inkubasiya edildi. Fermentlə müalicədən sonra membran 17000 q-da 4°C-də 1 saat ərzində santrifüjlə çıxarıldı. Gas1-GFP-ni immunçöküntüləmək üçün supernatant 4°C-də gecə ərzində GFP-Trap_A (ChromoTek) ilə inkubasiya edildi. SDS-PAGE ilə ayrılmış təmizlənmiş Gas1-GFP Kumassi parlaq mavisi ilə boyandı. Su kəmərinin ətrafındakı boz rəngdən Gas1-GFP boyama zolağı kəsildi və sonra yodoasetamidlə alkilləşmə və ditiotreitol ilə reduksiyadan sonra tripsinlə gel içi həzm aparıldı. Ekstrakt və GPI-qlikanlarla quru triptik peptidlər və peptidlər. Qurudulmuş peptid 20 μl suda həll edildi. Bir porsiya (8 μl) LC-yə yeridildi. Peptidləri müəyyən qradiyent şəraitində ayırmaq üçün oktadesilsilan (ODS) sütunundan (Develosil 300ODS-HG-5; daxili diametri 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aiçi Prefekturası, Yaponiya) istifadə edildi. Mobil faza A həlledicisindən (0.08% qarışqa turşusu) və B həlledicisindən (80% asetonitrildə 0.15% qarışqa turşusu) ibarətdir. Accela HPLC sistemi (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massaçusets) sütunu 5 dəqiqə ərzində 50 μl min-1 axın sürəti ilə A həlledicisi ilə elute etmək üçün istifadə edildi və sonra B həlledicisinin konsentrasiyası 40%-ə qədər artırıldı. , Amerika Birləşmiş Ştatları). Eluat davamlı olaraq ESI ion mənbəyinə daxil edildi və triptik peptidlər və GPI-qlikanlı peptidlər LTQ Orbitrap XL (hibrid xətti ion tələsi-orbitrap kütlə spektrometri; Thermo Fisher Scientific) ilə təhlil edildi. MS qurğusunda kapilyar mənbəyinin gərginliyi 4,5 kV-a təyin edildi və ötürücü kapilyarın temperaturu 300°C-də saxlanıldı. Kapilyar gərginliyi və boru linzasının gərginliyi müvafiq olaraq 15 V və 50 V-a təyin edildi. MS məlumatları müsbət ion rejimində (60.000 qətnamə; kütlə dəqiqliyi milyonda 10 hissə) 300/m/z kütlə/yük nisbəti (m/z) 3000 kütlə diapazonunda əldə edilmişdir. MS/MS məlumatları LTQ Orbitrap XL-dəki ion tələsi vasitəsilə əldə edilir [məlumatların asılı olduğu ilk 3 rəqəm, toqquşma ilə induksiya olunmuş dissosiasiya (CID)].
MD simulyasiyaları GROMACS (52) proqram təminatı və MARTINI 2 qüvvə sahəsi (53-55) istifadə edilərək aparılmışdır. Daha sonra CHARMM GUI Membran Qurucusu (56, 57) dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) və Cer C18 və ya DOPC və Cer C26 ehtiva edən ikiqat təbəqə qurmaq üçün istifadə edilmişdir. Cer C26-nın topologiyası və koordinatları sfinqozin quyruğundan əlavə muncuqları çıxarmaqla DXCE-dən əldə edilir. Aşağıda təsvir edilən prosesdən istifadə edərək ikiqat təbəqəni balanslaşdırın və onu işə salın, sonra sistemin son koordinatlarından istifadə edərək Emp24 ehtiva edən bir sistem qurun. Maya Emp24-ün transmembran domeni (qalıqlar 173-dən 193-ə qədər) vizual MD (VMD) alət molekulyar strukturundan (58) istifadə edərək α-heliks şəklində qurulmuşdur. Daha sonra, üst-üstə düşən lipidləri çıxardıqdan sonra, zülal qaba şəkildə dənəvərləşdirildi və CHARMM GUI istifadə edərək ikiqat təbəqəyə daxil edildi. Son sistem 1202 DOPC və 302 Cer C26 və ya 1197 DOPC və 295 Cer C18 və Emp24 ehtiva edir. Sistemi 0,150M konsentrasiyaya qədər ionlaşdırın. İki ikiqat tərkibli kompozisiya üçün dörd müstəqil təkrarlama hazırlanmışdır.
Lipid ikiqat təbəqəsi, 405.000 addımın minimuma endirilməsini və sonra balanslaşdırılmasını əhatə edən CHARMM GUI prosesindən istifadə edərək balanslaşdırılır. Bu prosesdə mövqe məhdudiyyətləri tədricən azaldılır və aradan qaldırılır, zaman addımı isə 0,005 ps-dən 0,02 ps-ə qədər artırılır. Tarazlaşdırıldıqdan sonra, 0,02 ps zaman addımı ilə 6 µs istehsal edir. Emp24 daxil edildikdən sonra, sistemi minimuma endirmək və balanslaşdırmaq üçün eyni CHARMM GUI prosesindən istifadə edin və sonra istehsalda 8 saniyə işlədin.
Bütün sistemlər üçün balanslaşdırma prosesi zamanı təzyiq Berendsen barostatı (59), istehsal prosesi zamanı isə təzyiq Parrinello-Rahman barostatı (60) tərəfindən idarə olunur. Bütün hallarda orta təzyiq 1 bardır və yarı izotrop təzyiq birləşdirmə sxemi istifadə olunur. Balanslaşdırma və istehsal prosesində müvafiq olaraq zülal, lipid və həlledici hissəciklərinin temperaturunu birləşdirmək üçün sürət yenidən kalibrləməsi olan termostat (61) istifadə olunur. Bütün əməliyyat zamanı hədəf temperaturu 310K-dir. Bağlanmayan qarşılıqlı təsir, 0,005 bufer tolerantlığı ilə Verlet sxemindən istifadə edərək birləşdirmə siyahısı yaratmaqla hesablanır. Kulon termini reaksiya sahəsi və 1,1 nm kəsmə məsafəsi istifadə edilərək hesablanır. Vander Waals termini 1,1 nm kəsmə məsafəsi olan kəsmə sxemindən istifadə edir və potensial sürüşmə üçün Verlet kəsmə sxemi istifadə olunur (62).
VMD istifadə edərək, DOPC fosfat muncuqları və ya seramid AM1 muncuqları ilə zülal arasındakı kəsmə dalğa uzunluğu 0,7 nm-dir və zülalla qarşılıqlı təsir göstərən lipidlərin sayı hesablanır. Aşağıdakı düstura əsasən, (63)-dəki kimi tükənmə-zənginləşmə (DE) faktorunu hesablayın: DE faktoru = (zülaldakı ümumi lipidlərin miqdarı 0,7) zülalda 0,7 (ümumi lipidlərdə Cer miqdarı)
Göstərilən dəyər orta qiymət kimi əldə edilir və xəta zolaqları SE-nin dörd müstəqil nüsxəsidir. DE faktorunun statistik əhəmiyyəti t testi [(averageDE-factor-1)/SE] ilə hesablanır. P dəyərini birquyruqlu paylanmadan hesablayın.
GROMACS aləti, izin son 250 ns-də Emp24 ehtiva edən sistemin 2D yan sıxlıq xəritəsini hesablamaq üçün istifadə edilmişdir. Keramidin zənginləşmə/tükənmə xəritəsini əldə etmək üçün Cer-in sıxlıq xəritəsi Cer və DOPC xəritəsinin cəminə, sonra isə bədəndəki Cer konsentrasiyasına bölünür. Eyni rəngli xəritə şkalası istifadə olunur.
Bu məqalə üçün əlavə materiallar üçün http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 linkinə baxın.
Bu, son istifadənin kommersiya məqsədi daşımadığı və orijinal əsərin düzgün olması şərtilə istənilən mühitdə istifadəyə, yayılmağa və çoxaldılmasına icazə verən Creative Commons Attribution-Qeyri-Kommersiya Lisenziyasının şərtləri altında paylanan açıq girişli məqalədir. İstinad.
Qeyd: Səhifəyə tövsiyə etdiyiniz şəxsin e-poçtu görməsini istədiyinizi və spam olmadığını bilməsi üçün yalnız e-poçt ünvanınızı təqdim etməyinizi xahiş edirik. Heç bir e-poçt ünvanını qeyd etməyəcəyik.
Bu sual, ziyarətçi olub-olmadığınızı yoxlamaq və avtomatik spam göndərilməsinin qarşısını almaq üçün istifadə olunur.
Sofia Rodrigez-Qallardo, Kazuo Kurokava, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Kortez · Qomez (Alejandro Kortes-Qomez), Atsuko İkeda (Atsuko İkeda), Valeriya Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Anaero Perez (L) Lopez), Miho Vaqa (Miho Vaqa), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prou ​​Akira, Stefano Fanni, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D yüksək qətnaməli real vaxt görüntüləmə, selektiv çıxış sahələrində zülal çeşidlənməsi üçün keramid zəncirinin uzunluğunun əhəmiyyətini ortaya qoyur.
Sofia Rodrigez-Qallardo, Kazuo Kurokava, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Kortez · Qomez (Alejandro Kortes-Qomez), Atsuko İkeda (Atsuko İkeda), Valeriya Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Anaero Perez (L) Lopez), Miho Vaqa (Miho Vaqa), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prou ​​Akira, Stefano Fanni, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D yüksək qətnaməli real vaxt görüntüləmə, selektiv çıxış sahələrində zülal çeşidlənməsi üçün keramid zəncirinin uzunluğunun əhəmiyyətini ortaya qoyur.
©2020 Elmin İnkişafı üzrə Amerika Assosiasiyası. bütün hüquqlar qorunur. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef və COUNTER-ın tərəfdaşıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.