Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS dəstəyi məhduddur. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
Onurğalılardan fərqli olaraq, həşəratların erkək yönümlü cinsi steroid hormonlarından məhrum olduğu geniş şəkildə düşünülür. Anopheles gambiae-də ekdizon steroidi 20-hidroksiekdizon (20E) dişilər tərəfindən sintez edildikdə yumurta inkişafını idarə etmək və erkəklər tərəfindən cinsi yolla ötürüldükdə cütləşməyə qarşı davamlı dövr yaratmaq üçün təkamül keçirmiş kimi görünür3. Yumurta inkişafı və cütləşmə vacib reproduktiv xüsusiyyətlər olduğundan, dişi Anopheles ağcaqanadlarının bu hormonal siqnalları necə inteqrasiya etdiyini anlamaq yeni malyariya nəzarət proqramlarının dizaynını asanlaşdıra bilər. Burada biz bu reproduktiv funksiyaların ekdisteroid aktivləşdirən/aktivləşdirən fermentlərin mürəkkəb şəbəkəsi vasitəsilə fərqli cinsi steroidlər tərəfindən tənzimləndiyini aşkar edirik. Cinsi ötürülmədən sonra qadın cinsi qəbulediciliyini dayandıraraq və defosforlaşma ilə aktivləşdirərək valideynliyi qoruyan erkəklərə xas oksidləşmiş ekdizon, 3-dehidro-20E (3D20E) müəyyən etdik. Xüsusilə, 3D20E ötürülməsi həmçinin Plasmodium infeksiyası zamanı yumurta inkişafını qoruyan və yoluxmuş dişilərin sağlamlığını təmin edən reproduktiv genlərin ifadəsini də stimullaşdırmışdır. Dişilərdən əldə edilən 20E edir cinsi reaksiya yaratmır, lakin 20E-inhibitor kinazlar inhibə edildikdən sonra cütləşən fərdlərin yumurta qoymasına imkan verir. Bu erkək spesifik həşərat steroid hormonunun müəyyən edilməsi və qadın cinsi reseptorluğunun, məhsuldarlığının və Plazmodiumla qarşılıqlı təsirinin tənzimlənməsindəki rolu malyariya ötürən ağcaqanadların reproduktiv uğurunu azaltmaq potensialını göstərir.
İnsan malyariya parazitlərinin yeganə vektoru olan Anopheles ağcaqanadlarında geniş yayılmış insektisid müqaviməti səbəbindən malyariya halları və ölüm halları yenidən artmaqdadır4. Bu ağcaqanadların cütləşmə biologiyası yeni malyariyaya qarşı mübarizə tədbirləri üçün xüsusilə cəlbedici bir hədəfdir, çünki dişilər yalnız bir dəfə cütləşir5; bu tək cütləşmə hadisəsini steril etmək sahədəki ağcaqanad populyasiyalarını azaltmaq üçün böyük potensiala malik olardı.
Qadınlar kişilərdən yüksək titrli steroid hormonları qəbul etdikdən sonra cinsi cəhətdən qabiliyyətsiz hala düşürlər. Tədqiqatlar göstərir ki, sonrakı cütləşmədə çətinlik yaradan amil, daha çox sürfə mərhələsindəki ərimə dövrünün tənzimləyicisi kimi tanınan steroid hormonu olan 20-hidroksiekdizon (20E)-dir. Erkəklərin 20E-ni sintez etmək və ötürmək qabiliyyəti, Afrikada yayılmış və Anopheles gambiae də daxil olmaqla, malyariyanın ən təhlükəli vektorlarını özündə birləşdirən Cellia7 altcinsinin bir hissəsi olan Anopheles növlərində xüsusilə inkişaf etmişdir. Bu, xüsusilə diqqətəlayiqdir, çünki bu növlərdə dişilər hər qan qidasından sonra 20E istehsal edir və 20E oogenez dövrünü idarə edir (bax: istinad 8). Lakin, dişilərin öz cütləşmə qabiliyyətlərini pozmadan iki fərqli ekdizon mənbəyindən (kişi ötürülməsi və qan qidalanması induksiyası) siqnalları necə birləşdirdikləri barədə az şey məlumdur. Əslində, dişilərin istehsal etdiyi 20E cinsi dözümsüzlüyü tetiklerse, bu, bakirə qidalanan fərdlərdə sonsuzluğa səbəb olacaq ki, bu da bu ağcaqanadlarda çox yaygın bir davranışdır5.
Mümkün bir izahat, A. gambiae erkəklərinin dişi reproduktiv traktında siqnal kaskadını aktivləşdirən və cütləşmə qeyri-sabitliyinə səbəb olan modifikasiya olunmuş erkək spesifik ekdizonu ötürməsidir. Lakin, onurğalılarda estrogen və androgen kimi çoxsaylı steroid hormonları olsa da (9-cu istinadda nəzərdən keçirilmişdir), bildiyimiz qədər, həşəratlarda androgenik yönümlü steroidlər müəyyən edilməmişdir.
Mümkün modifikasiyaedici steroidlər axtarışında cinsi yetkin A. gambiae-nin kişi kişi aksesuar vəzindəki (MAG) steroid hormonlarının repertuarını təyin etməyə başladıq. Əvvəllər istifadə edilən daha az spesifik metod əvəzinə, yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası ilə tandem kütlə spektrometriyası (HPLC-MS/MS) istifadə edərək, bu toxumada əvvəlki nəticəni təsdiqləyən ekdizon (E) və 20E aşkar etdik. Lakin, nümunədə 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 düsturuna uyğun olaraq oksidləşmiş fosforlaşdırılmış steroidlər üstünlük təşkil edirdi (Şəkil 1). Digər formalara 3-dehidro-20E (3D20E) və 20E-22-fosfat (20E22P) daxildir. 3D20E22P-nin HPLC-MS/MS siqnal intensivliyi onun defosforlaşdırılmış forması olan 3D20E-dən iki dəfə, E və 20E-dən isə üç dəfə çox idi (Şəkil 1). Baxmayaraq ki, digər hissələrində... bədən və aşağı reproduktiv trakt (LRT; Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 1a). Həmçinin, yeni bağlanmış (<1 günlük) erkək və dişilərdə ekdisteroidləri təhlil etdik və yalnız MAG-da 3D20E və 3D20E22P aşkar etdik; E, 20E və 20E22P hər iki cinsdə mövcud idi (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 1b). Bu məlumatlar göstərir ki, yetkin erkəklər A. gambiae-nin MAG-larında dişilər tərəfindən sintez olunmayan yüksək titrli modifikasiyaedici hormonlar istehsal edirlər.
MAG və dişi LRT (qulaqcıqlar, toxum kisəcikləri və parovarium daxil olmaqla) 4 günlük (4 günlük) bakirə erkəklərdən və bakirə və cütləşmiş dişilərdən (0,5, 3 və 12 hpm) parçalanmışdır. Bu toxumalardakı ekdizon HPLC-MS/MS ilə təhlil edilmişdir (orta ± sem; cütləşməmiş t-test, iki tərəfli, yalançı kəşf dərəcəsi (FDR) düzəldilmişdir; NS, əhəmiyyətli deyil; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 saat vs. 0,5 saat, P = 0,035; 12 saat vs. 3 saat, P = 0,0015; 12 saat vs. 0,5 saat, P = 0,030. 3D20E22P: 3 saat vs. 0,5 saat, P = 0,25; 12 saat vs. 3 saat, P = 0.0032; 12 saat vs. 0.5 saat, P = 0.015). Məlumatlar üç bioloji təkrardan götürülmüşdür. Maraq doğuran hər bir ekdizon üçün pik sahəsi hesablanmış və ağcaqanadların sayı ilə normallaşdırılmışdır. Ekdizon aşağıdakı kimi rənglə təmsil olunur: E, yaşıl; 20E, narıncı; 20E22P, bənövşəyi; 3D20E, mavi; 3D20E22P, çəhrayı. Əlavə edilmiş hissə ekdizon səviyyələrinin aşağı olduğunu göstərmək üçün y oxundakı miqyası artırır.
3D20E22P və 3D20E-nin cütləşmə zamanı ötürülüb-ötürülmədiyini araşdırmaq üçün cütləşmədən sonrakı müxtəlif vaxt nöqtələrində dişi LRT-ləri parçaladıq. Ekdizon bakirələrdə tapılmasa da, cütləşmədən dərhal sonra (cütləşmədən 0,5 saat sonra, hpm) LRT-də əhəmiyyətli miqdarda 3D20E22P müşahidə etdik, zamanla azalır, 3D20E səviyyələri isə əhəmiyyətli dərəcədə artdı (Şəkil 1). Kimyəvi yolla sintez edilmiş 3D20E-ni standart olaraq istifadə edərək, cütləşmə LRT-lərində bu steroid hormonunun səviyyələrinin 20E-dən ən azı 100 dəfə yüksək olduğunu müəyyən etdik (Genişləndirilmiş Məlumat Cədvəli 1). Beləliklə, 3D20E22P cütləşmə zamanı dişi LRT-yə ötürülən əsas erkək ekdizondur və onun defosforilləşdirilmiş forması olan 3D20E, cütləşmədən qısa müddət sonra çox bol olur. Bu, sonuncu ekdizon üçün dişi cütləşmədən sonrakı biologiyada mühüm rol oynadığını göstərir.
Xüsusi hazırlanmış bioinformatika boru kəmərindən istifadə edərək yeni bir RNT ardıcıllığı (RNT-seq) məlumat dəsti (Şəkil 2a) yaratdıqdan sonra, ekdizon kinaz (EcK), ekdizon oksidaz (EO) və 20E-modifikasiya olunmuş fosfataza genini kodlayan ekdizon axtardıq. EPP) reproduktiv toxumalarda ifadə olunur. Bir namizəd EPP genini və iki potensial EcK genini (EcK1 və EcK2) müəyyən etdik, lakin yaxşı bir namizəd EO genini tapa bilmədik. Xüsusilə, fərdi EPP genləri Qambiya MAG-larında yüksək səviyyədə (98.9-cu persentil) ifadə edildi, lakin qadın LRT-lərində deyil (Şəkil 2b), bu gözləntilərimizin əksinə olaraq, 3D20E22P-nin defosforlaşması bu qadın toxumasında baş verdiyi üçün. Buna görə də, kişi EPP-nin cütləşmə zamanı ötürülə biləcəyinə inanırıq. Həqiqətən də, cütləşmədən sonra qadın zülalını maskalamaq üçün in vivo stabil izotop etiketləməsindən istifadə etdik, bu ferment qadın atriumunda MS tərəfindən müəyyən edilir (Şəkil 2). 2c və Əlavə Cədvəl 1). MAG-da və cütləşdirilmiş (lakin bakirə olmayan) dişi LRT-də EPP-nin olması da spesifik antikorlardan istifadə etməklə təsdiqləndi (Şəkil 2d).
a, Hər cinsin reproduktiv toxumalarında EcK, EO və EPP kodlayan genləri axtarmaq üçün xüsusi hazırlanmış bioinformatika boru kəməri. Oxların yanındakı rəqəmlər hər addımda kişi və qadın namizədlərin sayını göstərir. Bu analiz kişilərdə ifadə olunan bir EPP geni (EPP) və bir EcK geni (EcK1) və hər iki cinsdə ifadə olunan, lakin namizəd EO geni verməyən bir EcK geni (EcK2) müəyyən etmişdir.b, Bakirə (V) və cütləşmə (M) Anopheles gambiae və Anopheles albicans toxumalarında namizəd gen ifadəsini müqayisə edən İstilik xəritəsi. Spca, mayalanma; MAGs, kişilərdə aksesuar vəzilər; Hər iki cinsdə döşlər, qanadlar, ayaqlar, piy bədənləri və daxili orqanlar, qadınlarda isə yumurtalıqlar daxil olmaqla bədənin digər hissələri. EcK2 Qambiyanın həm MAG, həm də qulaqcıqlarında yüksək dərəcədə ifadə olunur, EPP isə yalnız MAG.c-də tapılır. Kişi boşalma qrupunun qadın qulaqcıqlarına 3, 12 və 24 at gücü ilə translokasiyasının proteomik təhlili ən çox rast gəlinən 67 zülalı göstərir. Dişilər bütün zülalları etiketləmək (və maskalamaq) üçün 15N ehtiva edən bir pəhrizlə böyüdülmüşdür. Etiketlənməmiş erkəklər etiketlənmiş dişilərlə cütləşdirildi və proteomik analiz üçün dişi LRT-lər 3, 12 və 24 at gücü ilə parçalanmışdır (boşalma zülallarının tam siyahısı üçün Əlavə Cədvəl 1-ə baxın). Əlavə olaraq, bakirə kişilərin MAG-da bu toxumaların proteomik təhlili ilə EPP, Eck1 və EcK2 aşkar edilmişdir.d, EPP cütləşmiş dişilərin MAG və LRT-də qərb blotu ilə aşkar edilmişdir, lakin bakirə qadınlarda və ya kişilərdə və ya qadının qalan hissəsində deyil. bədən. Membranlar eyni vaxtda anti-aktin (yükləmə nəzarəti) və anti-EPP antikorları ilə sınaqdan keçirildi. Bütün kişilər bakirədir. Gel mənbəyi məlumatları üçün Əlavə Şəkil 1-ə baxın. Vestern blotları oxşar nəticələrlə iki dəfə aparıldı.
EPP-nin ekdisteroid fosfofosfataza aktivliyi, MAG-dan təcrid olunmuş 3D20E22P ilə HPLC-MS/MS ilə inkubasiya edildikdən sonra təsdiqləndi (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 2a). Bundan əlavə, RNT vasitəçiliyi ilə müdaxilə (RNTi) ilə EPP-ni susdurduğumuz zaman, bu erkəklərin reproduktiv toxumalarında fosfataza aktivliyində güclü bir azalma aşkar etdik (Şəkil 3a) və EPP-ni susdurmuş erkəklərlə cütləşən dişilər qismən gen susdurulmasına baxmayaraq, defosforlaşdırılmış 3D20E-nin əhəmiyyətli dərəcədə aşağı nisbətini göstərdilər (Şəkil 3b) (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 2b,c). Əksinə, eyni ağcaqanadlarda 20E22P/20E nisbətində əhəmiyyətli dəyişikliklər aşkar etmədik ki, bu da fermentin 3D20E22P üçün spesifik olduğunu göstərə bilər (Şəkil 3b).
a, İkiqat zəncirli EPP RNT (dsEPP) və ya ikiqat zəncirli GFP RNT (dsGFP) nəzarət qruplarından istifadə edərək EPP susdurulması nəticəsində MAG-da fosfataza aktivliyinin azalması. Hər təkrarlamada iyirmi MAG hovuzu istifadə edilmişdir (P = 0.0046, cüt t-testi, iki tərəfli), ayrı nöqtələrlə təmsil olunmuşdur. b, EPP susdurulmuş erkəklərlə cütləşdirilmiş dişilərdə 3 at gücü/dəq-də defosforilləşdirilmiş 3D20E nisbəti xeyli aşağı olmuşdur (P = 0.0043, cütləşdirilməmiş t-testi, iki tərəfli), 20E səviyyələri isə təsirlənməmişdir (P = 0.063, cütləşdirilməmiş). t-testi, ikitərəfli). Məlumatlar hər biri 13, 16 və 19 dişi olmaqla üç hovuzdan orta ± sem kimi təqdim olunur. c, EPP ilə susdurulmuş erkəklərlə cütləşdirilmiş dişilərdə təkrar cütləşmə nisbəti xeyli yüksək idi (P = 0.0002, Fişerin dəqiq testi, ikitərəfli). Dişilər cütləşmə statuslarını təmin etmək üçün əvvəlcə cütləşməyə məcbur edildi; 2 gün sonra, transgenin kəmiyyət PCR aşkarlanması ilə təkrar cütləşmə nisbətlərini qiymətləndirmək üçün transgen sperma daşıyan digər erkəklərlə əlaqə saxlanıldı. EPP ilə susdurulmuş erkəklərlə cütləşdirilmiş qanla qidalanan dişilərin məhsuldarlığı əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdı (P < 0.0001; Mann-Whitney testi, iki tərəfli) və yumurta sayı bir qədər azalmışdı (P = 0.088, Mann-Whitney testi, iki tərəfli), kürütökmə nisbəti isə təsirlənməmişdi (P = 0.94, Fişerin dəqiq testi, iki tərəfli). Bütün panellərdə n bioloji cəhətdən müstəqil ağcaqanad nümunələrinin sayını təmsil edir. NS, əhəmiyyətli deyil.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Daha sonra, dişilərdə cütləşmə müqavimətinin induksiyası üçün ekdizon defosforlaşmasının vacib olub-olmadığını qiymətləndirdik. Xüsusilə, EPP çatışmazlığı olan erkəklərlə cütləşən dişilər əlavə (transgen) erkəklərə məruz qaldıqda, nəzarət dişilərinə (10,4%) nisbətən daha yüksək tezlikdə (44,9%) təkrar cütləşdilər (Şəkil 3c). Həmçinin, məhsuldarlığın əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını (Şəkil 3d, solda) və bu dişilər tərəfindən qoyulan yumurtaların sayında bir qədər azalma müşahidə etdik (Şəkil 3d, ortada), dişilər tərəfindən qoyulan yumurtaların faizi (çiftleşme ilə dişilərdə yaranan başqa bir reaksiya)) təsirlənmədi (Şəkil 3d, sağda). 3D20E22P üçün müşahidə edilən EPP-nin spesifikliyini nəzərə alsaq, bu nəticələr göstərir ki, cütləşmə zamanı ötürülən EPP tərəfindən 3D20E-nin aktivləşməsi dişilərin daha çox cütləşməyə qarşı həssaslığının qarşısını almaqda mühüm rol oynaya bilər, bu davranış əvvəllər 20E-nin cinsi ötürülməsi ilə əlaqələndirilirdi. Buna görə də, bu kişiyə xas hormon qadınların məhsuldarlığına da güclü təsir göstərir.
Daha sonra, kimyəvi sintez edilmiş 3D20E (Şəkil 4a–c) və ticari olaraq mövcud olan 20E istifadə edərək cinsi yetkin bakirələrdə inyeksiya təcrübələrində 20E və 3D20E-nin aktivliyini müqayisə etdik. Müşahidə etdik ki, 3D20E hər iki konsentrasiyada dişilərin cütləşməyə həssaslığını söndürməkdə 20E-dən xeyli dərəcədə daha təsirli idi (Şəkil 4d). Xüsusilə, LRT-də 3D20E-nin fizioloji səviyyəsinin yarısı (inyeksiyadan sonra 1066 pg və cütləşmədən sonra 2022 pg) ən yüksək konsentrasiyada - 18 pg - inyeksiyadan 24 saat sonra 20E-nin fizioloji səviyyəsindən (inyeksiyadan sonra 361 pg) 20 dəfə yüksək olan refrakter dişilərin nisbətinə səbəb oldu; Genişləndirilmiş Məlumat Cədvəli 1). Bu nəticə 20E-nin cinsi ötürülməsinin cütləşməyə qarşı davamlı dövrlərə səbəb olmadığı fikri ilə uyğun gəlir və 3D20E-nin valideyn-övlad münasibətlərinin təmin edilməsində əsas amil olduğunu göstərir. 3D20E həmçinin bakirə dişilərdə yumurta qoyma testlərində 20E-dən xeyli daha aktiv idi (Şəkil 4e), bu da qismən EPP susdurulmasından sonra müşahidə etdiyimiz normal yumurta qoyma sürətinin cütləşmə ilə induksiya edilmiş dişi amillər tərəfindən hələ də istehsal olunan qalıq 3D20E aktivliyinin olması ilə əlaqəli olduğunu göstərir.
(a,b) 20E-dən kimyəvi yolla sintez edilmiş 3D20E (a) çox yüksək konversiya/səmərəliliklə (məlumatlar üç müstəqil sintez reaksiyasından orta ± sem kimi təqdim olunur) (b).c, Kütlə spektri (alt yarı) cütləşmiş dişi LRT-də (üst yarı).d tapılan ekdizonla tam uyğun gəlir. 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Fişerin dəqiq sınağı, iki tərəfli) və 10% etanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Fişerin dəqiq sınağı, 2 tərəfli) ilə müqayisədə, 20E isə yalnız daha yüksək dozalarda (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Fişerin dəqiq sınağı, 2 tərəfli) nəzarət qrupundan xeyli yüksək idi. 3D20E inyeksiyası bakirə dişilərdə 10% etanol nəzarət qrupuna nisbətən xeyli yüksək kürütökmə nisbətinə səbəb oldu (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Fişer dəqiq testi, ikitərəfli), nəzarət qrupu ilə müqayisədə isə 20E yalnız daha yüksək dozalarda (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Fişer dəqiq testi, ikitərəfli). 3D20E daha yüksək dozalarda (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Fişer dəqiq testi, ikitərəfli) 20E-dən xeyli yüksək kürütökmə nisbətlərinə səbəb oldu. Bütün panellərdə n bioloji cəhətdən müstəqil ağcaqanad nümunələrinin sayını təmsil edir. NS, əhəmiyyətli deyil.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Məlumatlar üç replikadan götürülmüşdür.
Əvvəlki tədqiqatlarda biz müəyyən etmişdik ki, steroid hormonlarının cinsi ötürülməsi, A. gambiae dişilərini P. falciparum infeksiyasından qoruyan qadın reproduktiv geni olan MISO-nun (Çütləşmə ilə İnduksiya Edilmiş Oogenez Stimulyatoru 11) ifadəsini induksiya edir. Bu genin ifadəsi ən ölümcül insan malyariya paraziti olan 13-ün yaratdığı sağlamlıq xərcləridir. Malyariya endemik ərazilərdə Anopheles-in reproduktiv sağlamlığı üçün MISO-nun əhəmiyyətini nəzərə alaraq, bu genin ifadəsini hansı 3D20E və ya 20E hormonunun tetiklediyini müəyyən etmək qərarına gəldik. Müəyyən etdik ki, 20E inyeksiyası HR3 və HR4 kimi bəzi nüvə hormon reseptorlarını (HR) və Vg14, 15, 16 kimi tipik aşağı axın steroid hədəflərini xüsusi və ya daha güclü şəkildə induksiya etsə də, MISO-nun 3D20E tərəfindən daha güclü şəkildə induksiya edildiyi aşkar edilmişdir (Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 3). Beləliklə, bu androgenik steroid hormonunun cinsi ötürülməsi, qadınları parazit infeksiyasının yaratdığı xərclərdən qoruyan mexanizmləri induksiya edir. Bundan əlavə, 3D20E hər iki izoforma fərqli şəkildə təsir göstərir. E reseptoru EcR-in EcR-ni induksiya etməsi və EcR-B-ni basdırması və qadın məhsuldarlığına təsir edən HPX15 də daxil olmaqla digər cütləşməyə səbəb olan genləri daha güclü şəkildə tetikləməsi. Bu, EPP ilə susdurulmuş erkəklərlə cütləşən qadınlarda müşahidə olunan əhəmiyyətli sonsuzluğu izah edə bilər (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 3). Bu məlumatlar cinsə xas funksiyanın əsasını təşkil edə biləcək iki ekdizon hormonu tərəfindən üstünlük verilən şəkildə aktivləşdirilmiş aşağı axın yollarının mövcudluğunu göstərir.
Daha sonra, bioinformatika boru kəmərimizdə müəyyən edilmiş iki EcK geninin funksiyasını sınaqdan keçirdik. EcK1 və ya EcK2-nin susdurulması kişilərdə əhəmiyyətli dərəcədə ölümə səbəb oldu (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 4a), bu da ekdizon fosforlaşmasının və beləliklə, inaktivləşmənin sağ qalma üçün vacib olduğunu göstərir. EcK2 EcK1-dən daha yüksək səviyyələrdə ifadə edildiyi və proteomika tərəfindən MAG-larda aşkar edildiyi üçün (Şəkil 2b, c və Əlavə Cədvəl 2), onun ekdisteroid kinaz aktivliyini 20E ilə inkubasiya edərək təsdiqlədik və bu da 20E22P fosforlaşması ilə nəticələndi (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 2).4b). 3D20E-ni substrat kimi istifadə edərkən, fosforlaşmış məhsul 3D20E22P-ni aşkar edə bilmədik (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 4c), bu da 3D20E əvəzinə 20E-nin EcK2-nin üstünlük verilən hədəfi ola biləcəyini göstərir.
RNT-seq analizimizə əsasən, EcK2 bakirə dişilərin LRT-də də yüksək dərəcədə ifadə olunmuşdur və cütləşmədən sonra söndürülmüşdür (Şəkil 2b). Bu məlumatları təsdiqlədik və EcK2 ifadəsinin qanla qidalanmadan təsirlənmədiyini müəyyən etdik (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 5a). İlkin MS təcrübələrimizi genişləndirərək, 20E22P zirvəsinin 20E zirvəsi ilə sıx əlaqəli olduğunu müəyyən etdik (qanla qidalanmadan 22-26 saat sonra; Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 5b). Bakirə dişilərdə EcK2-nin susdurulması qanla qidalanmadan 26 saat sonra 20E-nin 20E22P-yə nisbi nisbətində 3 dəfə artımla nəticələnmişdir (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 2c və 5c), bu da EcK2-nin dişilərdə də 20E-ni fosforlaşdırdığını təsdiqləyir. Xüsusilə, EcK2-dən tükənmiş bakirələrdə tam cinsi qəbuledicilik qorunub saxlanılmışdır (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 5d, e), bu da dişilərdə 20E istehsalının cütləşməyə səbəb olmadığını göstərir. refrakter dövrlər. Lakin, bu dişilərin nəzarət qrupuna nisbətən yumurta qoyma nisbəti əhəmiyyətli dərəcədə artmış, bakirələrin 30%-dən çoxu yumurta qoymuşdur (Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 5f). Əgər ikiqat zəncirli Eck2 RNT (dsEcK2) inyeksiyaları qanla qidalandıqdan sonra aparılıbsa, yumurtlama baş verməyib və bu zaman qan qəbulundan qaynaqlanan 20E zirvəsi azalıb. Ümumilikdə, bu nəticələr qan əmdikdən sonra istehsal olunan 20E-nin yumurtlamaya səbəb ola biləcəyi modeli dəstəkləyir, lakin yalnız yumurtlama bloku (EcK2 və ehtimal ki, digər amillər) cütləşmə ilə söndürüldükdə. Nə 20E, nə də 3D20E inyeksiyaları bakirələrdə EcK2 ifadəsini inhibə etməmişdir (Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 5g), bu da digər amillərin bu kinazın inhibisiyasına vasitəçilik etdiyini göstərir. Lakin, qanla qidalandıqdan sonra 20E səviyyələri cütləşmə narahatlığına səbəb olmaq üçün kifayət deyildi, lakin cinsi yolla ötürülən 3D20E-nin yüksək titrləri ilə effektiv şəkildə tetiklendi.
Nəticələrimiz A. gambiae-nin reproduktiv uğurunu tənzimləyən mexanizmlər haqqında mühüm məlumatlar verir. Erkəklərin dişilərin daha da cütləşməyə həssaslığını azaltmaqla valideynliyini təmin edən erkək spesifik modifikasiya olunmuş ekdizon olan 3D20E-nin yüksək titrlərini sintez etmək üçün təkamül keçirdiyi bir model ortaya çıxdı. Eyni zamanda, bu malyariya vektorları həmçinin erkək spesifik EPP-nin cinsi ötürülməsinə cavab olaraq dişilərdə 3D20E-ni aktivləşdirmək üçün səmərəli bir sistem inkişaf etdirmişdir. Bildiyimiz qədər, bu, həşəratlarda unikal və kritik bir funksiya yerinə yetirən erkək və dişi dominant steroid hormon sisteminin ilk nümunəsidir. Erkək spesifik ekdizon funksiyası irəli sürülmüş, lakin qəti şəkildə nümayiş etdirilməmişdir. Məsələn, əsasən təkzib edilmiş bir fərziyyə 18, bu funksiyaların 20E sələfi E1 tərəfindən yerinə yetirilə biləcəyidir. Məlumdur ki, Drosophilada monandriya, spesifik cinsi peptid reseptorları21,22 vasitəsilə qadın reproduktiv yolunu innervasiya edən neyronlarla qarşılıqlı təsir göstərən kiçik cinsi peptidlərin19,20 cinsi ötürülməsi ilə tetiklenir. Müəyyən etmək üçün əlavə iş tələb olunur. A. gambiae dişilərində 3D20E tərəfindən idarə olunan aşağı axın siqnalizasiya kaskadları və bu kaskadların ağcaqanadlar və Drosophila arasında qorunub saxlanıla biləcəyini müəyyən etmək.
Tədqiqatımızda müəyyən edilmiş 3D20E-nin qadın məhsuldarlığı və davranışında mühüm rolunu nəzərə alaraq, 3D20E sintezi və aktivləşməsinə aparan yollar gələcək ağcaqanad nəzarət strategiyaları üçün yeni imkanlar təqdim edir, məsələn, steril həşərat texnologiyası strategiyalarında rəqabətli steril erkəklərin əmələ gəlməsi. Vəhşi təbiətə buraxılması və ya bakirə oyunda 3D20E-ni təqlid etmək üçün istifadə olunur. 3D20E-nin erkəklərə xas funksiyası, A. gambiae və digər Cellia növləri spermalarını cütləşmə tıxaclarına laxtalandırmaq qabiliyyətini əldə etdikdə inkişaf etmiş ola bilər, çünki bu, çox sayda hormon və hormon aktivləşdirici fermentlərin səmərəli ötürülməsinə imkan verir. Öz növbəsində, monandriyanı tətbiq edən 3D20E təkamülü, dişilərin (MISO-nun yüksək ifadəsi vasitəsilə) malyariyanın yüksək yayıldığı ərazilərdə reproduktiv sağlamlığını dəstəkləmək üçün bir mexanizm təmin edir ki, bu da dolayı yolla Plazmodiumun ötürülməsinə töhfə verir. Dişi 20E-nin dişi Anopheles ağcaqanadlarında P. falciparum-un sağ qalmasına və böyüməsinə dərin təsir göstərdiyi göstərildiyi nəzərə alındıqda,24 həm erkək, həm də dişi steroid hormon yolları artıq ağcaqanad-parazit qarşılıqlı təsirlərinin əsas aspektləridir.
A. gambiae G3 ştammları standart həşərat şəraitində (26-28 °C, 65-80% nisbi rütubət, 12:12 saat işıq/qaranlıq fotoperiod) yetişdirilmişdir. Sürfələr toz halında balıq yemi (TetraMin Tropik Lopalar, Koi Dənəcikləri və Tetra Gölməçə Çubuqları 7:7:2 nisbətində) ilə bəslənmişdir. Yetkin ağcaqanadlara ad libitum 10% dekstroza məhlulu və həftəlik insan qanı verilmişdir (qan komponentlərini öyrənin). Bakirə ağcaqanadlar, ucları mikroskopiya ilə araşdırıldıqdan sonra pup mərhələsində cinsləri ayırmaqla əldə edilmişdir. DsRed transgenini daşıyan erkəklər əvvəllər təsvir edilmişdir.
Məcburi cütləşmə təcrübələri əvvəllər təsvir edilmiş protokollara uyğun olaraq aparılmışdır. Təbii cütləşmə üçün 4 günlük bakirə dişilər iki gecə cinsi yetkin bakirə erkəklərlə 1:3 nisbətində saxlanılmışdır. Erkəklərə dsEPP inyeksiyası edildiyi təcrübələr üçün birgə qəfəsləmə fosfataza aktivliyinin maksimum dərəcədə susdurulduğu inyeksiyadan sonrakı 3-4-cü günlərə təsadüf etmişdir (Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 2b).
Ağcaqanad toxumaları, qalan cəsədlər (bədənin qalan hissəsi) və ya bütün bədən 100% metanola parçalanaraq muncuqla homogenləşdirildi (2 mm şüşə muncuqlar, 2400 dövr/dəq, 90 san). Toxuma miqdarı və metanol həcmləri aşağıdakı kimi idi: bədənin qalan hissəsi, 1000 µl-də 50; MAG, 50–100 80 µl; dişi LRT, 25–50 80 µl. Çöküntü eyni həcmdə metanol ilə ikinci metanol ekstraksiyasına məruz qaldı. Hüceyrə qalıqları santrifüqləmə yolu ilə təmizləndi. Hər iki ekstraksiyadan alınan metanol birləşdirildi və azot axını altında quruduldu, sonra suda 80% metanolun aşağıdakı həcmlərində yenidən suspenziya edildi: bədənin qalan hissəsi, 50 µl; MAG və dişi LRT, 30 µl.
Nümunələr LC cihazına (Vanquish, Thermo Fisher) qoşulmuş kütlə spektrometrində (ID-X, Thermo Fisher) təhlil edildi. 5 µl nümunə 25 °C-də saxlanılan 3 µm, 100 × 4.6 mm ölçülü sütuna (Inspire C8, Dikma) vuruldu. LC üçün mobil fazalar A (su, 0.1% qarışqa turşusu) və B (asetonitril, 0.1% qarışqa turşusu) idi. LC qradiyenti aşağıdakı kimi idi: 1 dəqiqə ərzində 5% B, sonra 11 dəqiqə ərzində 100% B-yə qədər artırıldı. 100% -də 8 dəqiqədən sonra sütunu 5% B-də 4 dəqiqə yenidən tarazlaşdırın. Axın sürəti 0.3 ml min-1 idi. MS mənbəyində ionlaşma müsbət və mənfi rejimlərdə qızdırılan elektrosprey ionlaşması ilə həyata keçirilir.
Kütlə spektrometri tam MS rejimində 60.000 qətnamə ilə 350-dən 680-ə qədər m/z diapazonunda məlumatları ölçür. MS/MS məlumatları [M + H]+ (bütün hədəflər), [M - H2O + H]+ (bütün hədəflər) və [M - H]- (fosforlaşdırılmış hədəflər) üzərində əldə edilmişdir. MS/MS məlumatları heç bir standartın mövcud olmadığı hədəflərin ekdizon xüsusiyyətlərini təsdiqləmək üçün istifadə edilmişdir. Hədəflənməmiş ekdisteroidləri müəyyən etmək üçün nisbi bolluğu >15% olan bütün HPLC pikləri üçün MS/MS məlumatları təhlil edilmişdir. Bir spesifik nümunənin (bütün digər hədəflər) mütləq miqdarlarını və ya durulaşdırmalarını hesablamaq və onların bir kişidə tapılan miqdarlara ekvivalentliyini hesablamaq üçün təmiz standartlardan (20E, 3D20E) yaradılmış standart əyrilərdən istifadə edərək kəmiyyətləşdirin. 3D20E üçün kəmiyyətləşdirmə aşağıdakı əlavələrin cəmindən istifadə etməklə aparılmışdır: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Məlumatlar Tracefinder (versiya 4.1) istifadə edilərək çıxarıldı və kəmiyyətləndirildi. MS/MS məlumatları Xcalibur (versiya 4.4) istifadə edilərək təhlil edildi. E, 20E və 3D20E-nin MS spektrləri müvafiq standartlarla müqayisə edildi. 3D20E22P Girard reagenti ilə törəmə yolu ilə təhlil edildi. 20E22P m/z nisbəti ilə təhlil edildi.
3D20E22P MAG-dan təmizləndi. Təmizləmə HPLC-MS/MS analizi ilə eyni LC şərtləri altında kvadrupol kütlə əsaslı detektor (QDa, Acquity, Waters) ilə ultra-performanslı maye xromatoqraf (Acquity, Waters) istifadə edərək analitik miqyasda aparıldı. 3D20E22P-yə uyğun m/z əvvəllər müəyyən edilmiş eyni saxlama vaxtında aşkar edildikdə fraksiya toplanması tetiklendi. Daha sonra çıxarılan birləşmələrin saflığı yuxarıda təsvir edildiyi kimi HPLC-MS/MS ilə yoxlanıldı.
Ümumi RNT, istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq TRI reaktivi (Thermo Fisher) istifadə edərək 10-12 reproduktiv toxumadan və ya bədənin digər hissələrindən (başsız) çıxarıldı. RNT TURBO DNase (Thermo Fisher) ilə müalicə edildi. cDNT, istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Moloney siçan lösemi virusunun tərs transkriptazası (M-MLV RT; Thermo Fisher) istifadə edilərək sintez edildi. Tərs transkripsiya kəmiyyət PCR (RT-qPCR; Genişləndirilmiş Məlumat Cədvəli 2) üçün primerlər əvvəllər dərc edilmiş24 və ya Primer-BLAST26 istifadə edilərək hazırlanmışdı, üstünlük ölçüsü 70-150 bp olan və ekzon-ekzon qovşaqlarını əhatə edən məhsullara və ya Primer cüt primerlərinin ayrı ekzonlarına verildi. Üç-dörd bioloji replikadan olan cDNT nümunələri RT-qPCR üçün suda dörd qat durulaşdırıldı. Kəmiyyətləndirmə 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primerlər və 5 µl durulaşdırılmış cDNT ehtiva edən 15 µl replika reaksiyalarında aparıldı. Reaksiyalar bir üzərində aparıldı. QuantStudio 6 Pro real vaxt PCR sistemi (Thermo Fisher) və məlumatları Dizayn və Təhlil (versiya 2.4.3) istifadə edilərək toplanmış və təhlil edilmişdir. Bu tədqiqatda göstərildiyi kimi, nisbi miqdarlar qanla qidalanma 27 və ya cütləşmə 3 ilə ifadəsi əhəmiyyətli dərəcədə dəyişməyən ribosomal gen RpL19 (AGAP004422) ilə normallaşdırılmışdır.
RNT keyfiyyəti Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) istifadə edilərək yoxlanıldı. Illumina cüt uclu kitabxanaları MIT və Harvardın Broad İnstitutunda hazırlanaraq işlədildi. Ardıcıllıqla oxunmalar standart parametrlərlə HISAT2 (versiya 2.0.5) istifadə edərək A. gambiae genomuna (PEST ştammı, versiya 4.12) uyğunlaşdırıldı. Xəritələşdirmə keyfiyyəti (MAPQ) balları <30 olan oxunmalar Samtools (versiya 1.3.1) istifadə edilərək silindi. Genlərə xəritələşdirilmiş oxunmaların sayı standart parametrlərlə htseq-count (versiya 0.9.1) istifadə edilərək sayıldı. Normallaşdırılmış oxunma sayları hesablandı və R-də (versiya 4.0.3) DESeq2 paketi (versiya 1.28.1) istifadə edilərək diferensial gen ifadəsi təhlil edildi.
Ekdizonu modifikasiya edən gen namizədləri əvvəlcə PSI-BLAST alqoritmindən (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) istifadə edərək A. gambiae genomunda axtarış aparılaraq müəyyən edilmişdir. Aşağıdakı sorğu zülal ardıcıllığına malik parametrlər standart dəyərlərdən istifadə edilmişdir: Bombyx mori (Əlavə № NP_001038956.1), Musca domestica (Əlavə № XP_005182020.1, XP_005175332.1 və XP_011294434.1) və Microplitis demolitor (Əlavə № XP_008552646.1 və XP_008552645.1) və B. mori (Əlavə № NP_001036900), Drosophila melanogaster (Əlavə № NP_651202)-dən EcK, Apis mellifera (Əlavə № XP_394838) və Acyrthosiphon pisum (Əlavə № XP_001947166); və B. mori-dən EPP (Əlavə № XP_001947166) NP_001177919.1 və NP_001243996.1) və D. melanogaster-in EO-su (Əlavə № NP_572986.1) (addım 1). Daha sonra, Qambiyada reproduktiv toxumada (qadın LRT və ya MAG) yüksək mRNA ifadəsinə (milyon xəritələşdirilmiş oxunuşda >100 fraqment/kilobaz ekzon (FPKM) və ya >85%) əsaslanaraq filtr vuruşları aparılır (addım 2). Spesifikliyi artırmaq üçün, cütləşmə zamanı ekdizonu sintez etməyən və ya ötürməyən anopheles növü olan A. albimanus-un reproduktiv toxumasında da ifadə olunan namizəd fermentləri seçdik. Namizəd genlər A. albimanus reproduktiv toxumasında aşağı ifadəyə (<100 FPKM və ya <85-ci persentil) əsasən süzülmüşdür (addım 3). Son filtr kimi (addım 4), namizəd genlər aşağıdakılardan ən azı birini təmin etməlidir: (1) fərqli şəkildə ifadə olunan genlərin təhlilinə görə cütləşmədən sonra əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlmiş (P < 0.05) və (2) reproduktiv olmayan toxumalarda (< 85 % və ya <100 FPKM).
Bütün orqanizmin izotop etiketlənməsinə nail olmaq üçün əvvəllər təsvir edilmiş 28, 29, 30 metodlarını modifikasiya etdik. Qısaca desək, vəhşi tip Saccharomyces cerevisiae tip II (YSC2, Sigma) yeganə azot mənbəyi kimi (çəki/həcm) 2% qlükoza (G7528, Sigma), 1,7% amin turşusu olmayan və ammonium sulfat olan maya azot bazasında (BD Difco, DF0335) və 5% 15N ammonium sulfatda (NLM-713, >99%, Cambridge Izotop Laboratories) sınaqdan keçirildi. Maya santrifüqasiya yolu ilə çıxarıldı və ağcaqanad sürfələri pupasiyaya qədər sərbəst şəkildə bəsləndi. Dördüncü yaşda ölümün qarşısını almaq üçün balıq unu əlavə edildi (hər 300 sürfəyə 0,5 mq). Daha sonra cütləşmə zamanı ötürülən erkək proteomu təhlil etmək üçün etiketsiz erkəklərlə cütləşmə təcrübələrində yalnız dişilər istifadə edildi.
4-6 günlük 15N etiketli bakirə dişilər yaş uyğunlaşdırılmış, etiketsiz bakirə erkəklərlə cütləşməyə məcbur edildi. Uğurlu cütləşmə epiflüoresans mikroskopiyası altında cütləşmə tıxaclarının aşkarlanması ilə təsdiqləndi. 3, 12 və 24 at gücündə 45-55 cütləşən dişilərin qulaqcıqları 50 µl ammonium bikarbonat buferinə (pH 7.8) parçalandı və pestle ilə homogenləşdirildi. Homogenat santrifüj edildi və supernatant 50 mM ammonium bikarbonatda 50 µl 0.1% RapiGest (186001860, Waters) ilə qarışdırıldı. Hər nümunədən alınan supernatant və qranul quru buzda donduruldu və bir gecədə LC-MS/MS üçün nümunə hazırlığının tamamlandığı Vaşinqton Universitetinin MacCoss laboratoriyasına göndərildi. Qranulu 50 mM ammoniumda 50 µl 0.1% RapiGest-də yenidən suspenziya edin. su hamamında bikarbonat və sonikat. Qranul və supernatantın zülal konsentrasiyası BCA analizi ilə ölçüldü, nümunələr 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma) ilə azaldıldı, 15 mM yodoasetamid (Sigma) ilə alkilləşdirildi və 37 °C-də (1:0 50) 1 saat ərzində tripsinləşmə: tripsin: substrat nisbəti ilə inkubasiya edildi. RapiGest 200 mM HCl əlavə edilməklə lizis edildi, ardınca 37 °C-də 45 dəqiqə inkubasiya və 4 °C-də 10 dəqiqə ərzində 14000 dövr/dəq-də santrifüqasiya edildi. Nümunələr ikili rejimli bərk fazalı ekstraksiya (Oasis MCX kartricləri, Waters) ilə yuyuldu və 0,33 µg µl-1 son protein konsentrasiyası üçün 0,1% qarışqa turşusunda yenidən suspenziya edildi. Etiketsiz MAG proteomları da oxşar şəkildə bakirədən təhlil edildi. Kişilər. Hər nümunə üçün iki analitik təkrar təhlil edildi. Daha sonra, hər birindən 1 µq, Jupiter C12 tərs fazalı qətran (Phenomenex) ilə doldurulmuş 4 sm-lik əridilmiş silisium Kasil1 (PQ) frit tələsi və 180 dəqiqəlik maye xromatoqrafiyası ilə 25 sm-lik əridilmiş silisium 75 μm sütun istifadə edilərək təhlil edildi. Nümunə daycestləri – MS/MS, nanoACQUITY UPLC Sistemi (Waters) ilə Q-Exactive HF kütlə spektrometrində (Thermo Fisher) işlədildi. Hər bir iş üçün yaradılan məlumatlarla əlaqəli əldə etmə məlumatları, Anopheles gambiae (VectorBase versiyası 54), Anopheles coluzzi-dən zülal ardıcıllıqlarını ehtiva edən FASTA verilənlər bazasına qarşı Proteowizard (versiya 3.0.20287) və Comet31 (versiya 3.2) istifadə edərək mzML formatına çevrildi. Mali-NIH (VectorBase versiyası 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Mart 2021), A. gambiae RNT-seq və məlum insan çirkləndiricilərinin üç çərçivəli tərcümələri üzərində axtarış aparıldı. Peptid xəritəsi ilə uyğunlaşdırılmış FDR-lər Percolator32 (versiya 3.05) istifadə edərək 0.01 həddi ilə təyin edildi və peptidlər Limelight33-də zülal parsimoniyası istifadə edərək zülal identifikasiyalarına yığıldı. (versiya 2.2.0). Nisbi zülal bolluğu, əvvəllər təsvir edildiyi kimi, hər bir mərhələdə hər bir zülal üçün hesablanmış normallaşdırılmış spektral bolluq faktoru (NSAF) istifadə edilərək qiymətləndirilmişdir. Hər bir zülala nisbətən NSAF iki fərqli bioloji replikadan götürülmüş nümunələr üzrə orta hesablanmışdır. 15N etiketləmə dişi proteomu uğurla maskalamışdır, baxmayaraq ki, etiketlənmiş bakirələrdən az miqdarda etiketlənməmiş zülal aşkar edilə bilər. Dişi xam nümunələrdə erkək zülalının azalmasının (1-5 spektr) aşkarlanmasını yalnız texniki mərhələlərdə qeydə aldıq, burada xam nümunələr HPLC-nin "daşıması" nəticəsində erkək/cütləşmə nümunələrindən sonra işlədildi. Etiketlənmiş bakirələrdən "çirkləndiricilər" kimi tapılan bəzən zülallar Əlavə Cədvəl 1-də verilmişdir.
Genscript-də iki antigenik peptid, QTTDRVAPAPDQQQ (PA izotipi daxilində) və MESDGTTPSGDSEQ (PA və PB izotipi daxilində). İki peptid birləşdirildi, sonra daşıyıcı zülal KLH ilə birləşdirildi və Yeni Zelandiya dovşanlarına vuruldu. Dördüncü inyeksiyadan sonra dovşanlar kəsildi və ümumi IgG affinlik təmizlənməsi ilə təcrid edildi. Ən çox EPP-yə xas dovşandan alınan IgG sonrakı qərb blotinqi üçün istifadə edildi.
Qərb ləkələri üçün, 4 günlük bakirə erkəklərdən və bakirə və ya məcburi cütləşdirilmiş dişilərdən (<10 cütləşmədən sonra) MAG (n = 10) və dişi LRT (n = 30) ayrıca əlavə edildi. Zülal ekstraksiya buferi (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% natrium deoksikolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteaza inhibitor kokteyli (Roche)) ayrıca əlavə edildi. Nümunələr disseksiyadan dərhal sonra muncuqla (2 mm şüşə muncuqlar, 2400 dövr/dəq, 90 san) homogenləşdirildi. Həll olmayan qalıqlar 20000 q-da 4 °C-də santrifüqləmə yolu ilə təmizləndi. Zülallar Bradford analizi (Bio-Rad) ilə kəmiyyətləndirildi. Daha sonra 20 µq MAG zülalı, 40 µq LRT zülalı və 20 µq Qalıq toplu zülal MOPS buferindən istifadə edərək 10% Bis-Tris NuPAGE ilə denaturasiya edildi və ayrıldı. Zülallar iBlot2 ötürmə sistemi (Thermo Fisher) istifadə edərək poliviniliden flüorid membranlarına köçürüldü. Membranlar iki dəfə 1× PBS-T-də (PBS-də 0,1% Tween-20) yuyuldu və sonra 22°C-də 1 saat ərzində Odyssey bloklayıcı buferində (Li-Cor) bloklandı. Membranlar 4°C-də xüsusi dovşan anti-EPP poliklonal ilkin antikoru (bloklayıcı buferdə 1:700) və siçovul anti-aktin monoklonal ilkin antikoru MAC237 (Abeam; 1:4,000) ilə gecə çalxalandı. Membranlar PBS-T ilə yuyuldu və sonra 0,01% SDS və 0,01% SDS ehtiva edən bloklayıcı buferdə ikincili antikorlar (eşşək anti-dovşan 800CW və keçi anti-siçovul 680LT (Li-Cor), hər ikisi 1:20,000) ilə inkubasiya edildi. 22 °C-də 1 saat ərzində 0,2% Tween -20 məhlulu ilə müalicə edildi. Membranlar PBS-T ilə yuyuldu və Odyssey CLx skaneri ilə görüntüləndi. Şəkillər Image Studio-da toplandı və emal edildi (versiya 5.2). EPP-RA izoformasına (82 kDa) uyğun spesifik zolaq aşkarlanmadı.
EPP-nin kodlaşdırma bölgələri (histidin fosfataza domenini ehtiva edən AGAP002463-RB izoformu, NCBI qorunan domen axtarışı 34) və EcK2 (AGAP002181) pET-21a(+) plazmidinə (Novagen Millipore Sigma) klonlanmışdır; praymerlər Genişləndirilmiş Məlumat Cədvəli 2-də sadalanmışdır. pET-21a(+)-EcK2 konstruksiyasının C-terminal 6xHis etiketindən əvvəl səkkiz GS4 bağlayıcısı (tandemdə) daxil edilmişdir. Rekombinant zülallar NEBExpress hüceyrəsiz E. coli zülal sintez reaksiyasından (New England BioLabs) istifadə edilərək istehsal edilmişdir. Rekombinant zülallar NEBExpress Ni spin sütunlarından (New England BioLabs) istifadə edilərək təmizlənmişdir. Dihidrofolat reduktaza (DHFR) nəzarət zülalı NEBExpress Hüceyrəsiz E. coli Zülal Sintezi Dəstindən DNT şablonundan istifadə edilərək istehsal edilmişdir. Zülallar 50% qliserolda PBS-də -20 °C-də 3 aya qədər saxlanılmışdır.
EPP və toxuma ekstraktlarının fosfataza aktivliyi 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich) istifadə edilərək ölçüldü. Reaksiya buferində 25 mM Tris, 50 mM sirkə turşusu, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA və 1 mM DTT var idi. Toxuma reaksiya buferində homogenləşdirildi və hüceyrə qalıqları santrifüqləmə yolu ilə təmizləndi. 2.5 mq ml-1 pNPP ehtiva edən reaksiya buferinə ferment və ya toxuma ekstraktı əlavə etməklə reaksiyaya başlayın. Reaksiya qarışığı otaq temperaturunda qaranlıqda inkubasiya edildi və pNPP-dən çevrilən pNP miqdarı müxtəlif vaxtlarda 405 nm-də absorbsiyanı ölçməklə kəmiyyətləndirildi.
In vitro EcK aktivliyi üçün zülal 27°C-də 2 saat ərzində 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP və 10 mM MgCl2 tərkibli 200 µl buferdə (pH 7.5) 0.2 mq 20E və ya 3D20E ilə inkubasiya edildi. Reaksiya 800 µl metanol əlavə edilərək dayandırıldı, sonra -20°C-də 1 saat soyuduldu, sonra 20000 q-da 4°C-də 10 dəqiqə santrifüj edildi. Daha sonra supernatant HPLC-MS/MS ilə təhlil edildi. Nəzarət qrupunda istifadə olunan zülalları istiliklə deaktivləşdirmək üçün zülallar 95°C-də 20 dəqiqə ərzində PBS-də 50% qliserolda inkubasiya edildi.
In vitro EPP aktivliyi üçün zülal, 25 mM Tris, 50 mM sirkə turşusu, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA və 1 mM DTT ehtiva edən 100 µl buferdə (pH 7.5) 3D20E22P (18 cüt MAG-da tapılan miqdara bərabərdir) ilə 27 °C-də 3 saat ərzində inkubasiya edildi. Reaksiya 400 µl metanol əlavə edilərək dayandırıldı və -20 °C-də 1 saat soyuduldu, sonra 20000 g-də 4 °C-də 10 dəqiqə ərzində santrifüj edildi. Supernatant HPLC-MS/MS ilə təhlil edildi.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) və EcK2 (556 bp) üçün PCR fraqmentləri qarışıq cinsli başsız ağcaqanad cəsədlərindən hazırlanmış kDNT-dən gücləndirilmişdir. eGFP nəzarətinin (495 bp) PCR fraqmenti əvvəllər təsvir edilmiş pCR2.1-eGFP-dən gücləndirilmişdir; PCR praymerləri Genişləndirilmiş Məlumat Cədvəli 2-də sadalanmışdır. PCR fraqmenti pL4440 plazmidindəki tərs çevrilmiş T7 promotorları arasına daxil edilmişdir. Plazmid konstruksiyaları NEB 5-α səlahiyyətli E. coli-dən (New England Biolabs) götürülmüş və istifadədən əvvəl DNT ardıcıllığı ilə təsdiqlənmişdir (əlavə ardıcıllığı üçün Əlavə Məlumat 1-ə baxın). T7 promotoruna (Genişləndirilmiş Məlumat Cədvəli 2) uyğunlaşdırılmış praymerlər pL4440 əsaslı plazmiddən əlavəni gücləndirmək üçün istifadə edilmişdir. PCR məhsulunun ölçüsü agaroza gel elektroforez ilə təsdiqlənmişdir. dsRNA Megascript T7 Transkripsiya Dəsti (Thermo Fisher) istifadə edərək PCR şablonlarından transkripsiya edilmiş və əvvəllər təsvir edilmiş dəyişikliklərlə istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq təmizlənmişdir.
dsRNA inyeksiyası üçün, ekloziyadan sonrakı 1 gün ərzində yetkin erkək və ya dişilərin (Nanoject III, Drummond) döş qəfəsinə 10 ng nl-1 konsentrasiyasında 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) yeridildi. Genlərin dekompozisiya səviyyələri ən azı üç bioloji replikada RNT ekstraksiyası, kDNA sintezi və RT-qPCR yolu ilə təyin edildi. Ekdizon inyeksiyası üçün, 4 günlük bakirə və ya 6 günlük bakirə qanla qidalanan dişilərə, eksperimental dizayndan asılı olaraq, müvafiq olaraq 1,3, 2,1 konsentrasiyalarında 0,13, 0,21 və ya 0,63 µg 20E və ya 3D20E (Nanoject III, Drummond) yeridildi və ya 6,3 ng nl-1 yeridildi. 10%-lik (həcm/həcm) 100 nl yeridin. suda etanol; 10% etanolda 100 nl 3D20E22P (bir cüt MAG-da tapılan miqdarın 75%-nə bərabərdir). Ağcaqanadlar təsadüfi olaraq inyeksiya qrupuna təyin edildi.
Kürü tökmə analizləri üçün 3 günlük dişilər insan qanı ilə ad libitum ilə qidalandırıldı. Qismən qidalanan və ya qidalanmamış ağcaqanadlar çıxarıldı. Müalicədən asılı olaraq, dişilər qan yeməyindən ən azı 48 saat sonra dörd gecə ayrı kürü tökmə qablarına yerləşdirildi. Yumurtalar stereoskop (Stemi 508, Zeiss) altında sayıldı; cütləşən dişilər üçün sürfəyə çevrilən yumurtalar məhsuldar hesab edildi.
Cütləşmə sınaqları üçün dişilərə müalicədən asılı olaraq cütləşməyə qarşı müqavimət inkişaf etdirmək üçün ən azı 2 gün vaxt verildi və vəhşi tipli yaş uyğun erkəklər sonradan eyni qəfəsə daxil edildi. İki gecə sonra dişi mayalanmış veziküllər parçalandı və 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA və 25 mM NaCl (pH 8.2) ehtiva edən buferdə dondurma-ərimə və ultrasəslə genom DNT-si buraxıldı. Nümunələr 55 °C-də 15 dəqiqə Proteinaz K (0.86 µg µl-1) ilə, ardınca 95 °C-də 10 dəqiqə inkubasiya edildi. Xam genom DNT preparatları 10 dəfə durulaşdırıldı və Y xromosom ardıcıllıqlarının qPCR aşkarlanmasına məruz qaldı; praymerlər Genişləndirilmiş Məlumat Cədvəli 2-də sadalanmışdır. Y xromosom ardıcıllığının olmaması cütləşmənin olmadığını göstərir.
Təkrar cütləşmə testləri üçün məcburi cütləşmiş dişilər cütləşmə statusunu təsdiqləmək üçün cütləşmə tıxaclarının mövcudluğuna görə müayinə edildi və əvvəllər təsvir edildiyi kimi 36 erkəklərin olmadığı halda cütləşməyə qarşı müqavimətin inkişaf etdirilməsi üçün 2 gün vaxt verildi. DsRed transgen sperma daşıyan erkəklər daha sonra dişi qəfəslərə daxil edildi. İki gecə sonra dişilərdən mayalanma vezikülləri ayrıldı və genom DNT-si yuxarıda təsvir edildiyi kimi hazırlandı və DsRed transgeninin qPCR aşkarlanmasına məruz qaldı; praymerlər Genişləndirilmiş Məlumat Cədvəli 2-də sadalanmışdır. DsRed transgeninin olmaması təkrar cütləşmənin baş vermədiyini göstərdi.
3D20E əvvəllər təsvir edildiyi kimi sintez edilmişdir 37. Qısaca desək, 10 mq 20E (Sigma-Aldrich) 10 ml suda həll edildi, ardınca 30 mq platin qara (toz şəklində, Sigma-Aldrich) əlavə edildi. Reaksiya qarışığına davamlı olaraq O2 axını köpükləndi və otaq temperaturunda qarışdırıldı. 6 saatdan sonra reaksiyanı dayandırmaq üçün 30 ml metanol əlavə edildi. Qarışıq katalizator hissəciklərini çıxarmaq üçün santrifüj edildi. Supernatant otaq temperaturunda vakuumda quruyana qədər buxarlandı. Qurudulmuş reaksiya məhsulu HPLC-MS/MS analizi üçün inyeksiya üçün 10% etanol və metanolda həll edildi. Çevrilmə sürəti (20E-dən 3D20E-yə qədər) təxminən 97% idi (Şəkil 4b) və sintez edilmiş 3D20E-nin MS spektri cütləşmiş dişilərdə olan spektrlə uyğun gəldi (Şəkil 4c).
Əfsanədə aparılan statistik testlərin konkret təfərrüatları var. Fişerin dəqiq testini, Mantel-Koks testini və Studentin t-testini yerinə yetirmək üçün GraphPad (versiya 9.0) istifadə edilmişdir. Cochran-Mantel-Haenszel testləri xüsusi R skriptindən istifadə etməklə aparılmışdır (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test saytında mövcuddur). Məlumatların paylanması 0,05 əhəmiyyət həddi ilə Şapiro-Uilk testindən istifadə edərək normallıq üçün sınaqdan keçirilmişdir. Məlumatlar normallıq testindən keçə bilmədikdə, Mann-Uitni testi aparılmışdır. Sağ qalma məlumatları Mantel-Koks testindən istifadə edərək təhlil edilmişdir. DESeq2 paketi (versiya 1.28.1) RNT-seq gen səviyyəli diferensial ifadə təhlilini aparmaq üçün istifadə edilmişdir. Qrafikdəki üfüqi zolaq medianı təmsil edir. Bütün testlər üçün eşik kimi P = 0,05 əhəmiyyət dəyəri istifadə edilmişdir.
Tədqiqat dizaynı haqqında daha çox məlumat üçün bu məqaləyə keçid verilmiş Təbiət Tədqiqatı Hesabatının xülasəsinə baxın.
MS proteomik məlumatları PXD032157 məlumat dəsti identifikatoru ilə PRIDE Tərəfdaş Repozitoriyası (https://www.ebi.ac.uk/pride/) vasitəsilə ProteomeXchange Konsorsiumuna (http://proteomecentral.proteomexchange.org) daxil edilmişdir.
RNT-seq verilənlər bazası Gen İfadəsi Kompleks Kitabxanasında (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) GSE198665 seriya qeydi altında saxlanılır.
Mövcud tədqiqat zamanı yaradılan və/və ya təhlil edilən əlavə məlumat dəstləri ağlabatan tələb əsasında müvafiq müəlliflərdən əldə edilə bilər. Bu məqalədə mənbə məlumatları təqdim olunur.
De Loof, A. Ekdisteroidlər: Laqeyd edilən həşərat cinsi steroidləri? Erkək: Qara Qutu. Həşərat Elmi.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdizon və Anopheles stephens-də yumurtalıq inkişafı. J. Həşərat Fiziologiyası.28, 97–109 (1982).