Göbələk əleyhinə vasitə və ümumi pəhriz əlavəsi olan propion turşusunun (PPA) siçanlarda mədə-bağırsaq disfunksiyası ilə müşayiət olunan anormal neyroinkişafına səbəb olduğu göstərilmişdir ki, bu da bağırsaq disbiozundan qaynaqlana bilər. Pəhriz PPA-ya məruz qalma ilə bağırsaq mikrobiota disbiozu arasında əlaqə təklif edilmişdir, lakin birbaşa araşdırılmamışdır. Burada disbioza səbəb ola biləcək bağırsaq mikrobiota tərkibində PPA ilə əlaqəli dəyişiklikləri araşdırdıq. Müalicə olunmamış pəhrizlə (n=9) və PPA ilə zənginləşdirilmiş pəhrizlə (n=13) qidalanan siçanların bağırsaq mikrobiomları mikrob tərkibindəki və bakterial metabolik yollardakı fərqləri qiymətləndirmək üçün uzunmüddətli metagenomik ardıcıllıqla ardıcıllıqla müəyyən edilmişdir. Pəhriz PPA, əvvəllər PPA istehsalında iştirak edən bir neçə Bacteroides, Prevotella və Ruminococcus növləri də daxil olmaqla əhəmiyyətli taksonların bolluğunun artması ilə əlaqələndirilmişdir. PPA-ya məruz qalan siçanların mikrobiomlarında lipid metabolizması və steroid hormon biosintezi ilə əlaqəli daha çox yol var idi. Nəticələrimiz göstərir ki, PPA bağırsaq mikrobiotasını və onunla əlaqəli metabolik yolları dəyişdirə bilər. Müşahidə olunan bu dəyişikliklər, istehlak üçün təhlükəsiz kimi təsnif edilən konservantların bağırsaq mikrobiotasının tərkibinə və öz növbəsində insan sağlamlığına təsir göstərə biləcəyini vurğulayır. Bunların arasında təhlil edilən təsnifat səviyyəsindən asılı olaraq P, G və ya S seçilir. Yalançı müsbət təsnifatların təsirini minimuma endirmək üçün minimum nisbi bolluq həddi 1e-4 (1/10.000 oxunuş) qəbul edilmişdir. Statistik təhlildən əvvəl Bracken tərəfindən bildirilən nisbi bolluqlar (fraction_total_reads) mərkəzləşdirilmiş logarifm nisbəti (CLR) transformasiyasından istifadə edilərək transformasiya edilmişdir (Aitchison, 1982). CLR metodu məlumatların transformasiyası üçün seçilmişdir, çünki o, miqyas baxımından dəyişməzdir və seyrək olmayan məlumat dəstləri üçün kifayətdir (Gloor və b., 2017). CLR transformasiyasında təbii loqarifm istifadə olunur. Bracken tərəfindən bildirilən say məlumatları nisbi logarifm ifadəsi (RLE) istifadə edilərək normallaşdırılmışdır (Anders və Huber, 2010). Rəqəmlər matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 və ardıcıl loqarifmlərin kombinasiyasından istifadə edilərək yaradılmışdır (Gloor və b., 2017). 0.12.2 və stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier və b., 2022). Bacillus/Bacteroidetes nisbəti hər nümunə üçün normallaşdırılmış bakteriya sayından istifadə etməklə hesablanmışdır. Cədvəllərdə göstərilən dəyərlər 4 onluq yerlərə yuvarlaqlaşdırılıb. Simpson müxtəliflik indeksi KrakenTools v. 1.2 paketində (Lu və b., 2022) təqdim edilən alpha_diversity.py skriptindən istifadə etməklə hesablanmışdır. Bracken hesabatı skriptdə, -an parametri üçün isə Simpson indeksi "Si" verilmişdir. Bolluqdakı əhəmiyyətli fərqlər orta CLR fərqləri ≥ 1 və ya ≤ -1 kimi müəyyən edilmişdir. Orta CLR fərqi ±1 nümunə növünün bolluğunda 2,7 dəfə artım göstərir. İşarəsi (+/-) taksonun müvafiq olaraq PPA nümunəsində və nəzarət nümunəsində daha çox olub olmadığını göstərir. Əhəmiyyət Mann-Whitney U testi (Virtanen və b., 2020) istifadə edilərək müəyyən edilmişdir. Statsmodels v. 0.14 (Benjamini və Hochberg, 1995; Seabold və Perktold, 2010) istifadə edilmiş və çoxsaylı testləri düzəltmək üçün Benjamini-Hochberg proseduru tətbiq edilmişdir. Statistik əhəmiyyəti müəyyən etmək üçün eşik kimi tənzimlənmiş p-dəyəri ≤ 0.05 istifadə edilmişdir.
İnsan mikrobiomu tez-tez "bədənin son orqanı" adlandırılır və insan sağlamlığında mühüm rol oynayır (Baquero və Nombela, 2012). Xüsusilə, bağırsaq mikrobiomu sistem miqyaslı təsiri və bir çox vacib funksiyalardakı rolu ilə tanınır. Bağırsaqda çoxlu sayda kommensal bakteriyalar mövcuddur, bir çox ekoloji nişləri tutur, qida maddələrindən istifadə edir və potensial patogenlərlə rəqabət aparır (Jandhyala və b., 2015). Bağırsaq mikrobiotasının müxtəlif bakterial komponentləri vitaminlər kimi vacib qida maddələri istehsal etməyə və həzmi təşviq etməyə qadirdir (Rowland və b., 2018). Bakterial metabolitlərin də toxuma inkişafına təsir etdiyi və metabolik və immun yollarını gücləndirdiyi göstərilmişdir (Heijtz və b., 2011; Yu və b., 2022). İnsan bağırsaq mikrobiomunun tərkibi son dərəcə müxtəlifdir və pəhriz, cins, dərmanlar və sağlamlıq vəziyyəti kimi genetik və ətraf mühit amillərindən asılıdır (Kumbhare və b., 2019).
Ananın qidalanması dölün və yenidoğulmuşun inkişafının vacib bir komponenti və inkişafa təsir göstərə biləcək birləşmələrin ehtimal olunan mənbəyidir (Bazer və b., 2004; Innis, 2014). Maraq doğuran belə birləşmələrdən biri bakterial fermentasiyadan əldə edilən qısa zəncirli yağ turşusu yan məhsulu və qida əlavəsi olan propion turşusudur (den Besten və b., 2013). PPA antibakterial və göbələk əleyhinə xüsusiyyətlərə malikdir və buna görə də qida qoruyucusu kimi və sənaye tətbiqlərində kif və bakteriyaların böyüməsini maneə törətmək üçün istifadə olunur (Wemmenhove və b., 2016). PPA müxtəlif toxumalarda fərqli təsirlərə malikdir. Qaraciyərdə PPA makrofaqlarda sitokin ifadəsinə təsir edərək iltihab əleyhinə təsir göstərir (Kawasoe və b., 2022). Bu tənzimləyici təsir digər immun hüceyrələrində də müşahidə olunub və bu da iltihabın aşağı tənzimlənməsinə gətirib çıxarıb (Haase və b., 2021). Lakin, beyində əks təsir müşahidə olunub. Əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, PPA-ya məruz qalma siçanlarda autizmə bənzər davranışa səbəb olur (El-Ansary və b., 2012). Digər tədqiqatlar göstərir ki, PPA qliozu induksiya edə və beyində iltihabi yolları aktivləşdirə bilər (Abdelli və b., 2019). PPA zəif bir turşu olduğundan, bağırsaq epitelindən qan dövranına yayıla və beləliklə, qan-beyin baryeri, eləcə də plasenta da daxil olmaqla məhdudlaşdırıcı maneələri keçə bilər (Stinson və b., 2019), bu da PPA-nın bakteriyalar tərəfindən istehsal olunan tənzimləyici metabolit kimi əhəmiyyətini vurğulayır. PPA-nın autizm üçün risk faktoru kimi potensial rolu hazırda araşdırılmaqda olsa da, autizmli insanlara təsiri neyron differensiasiyasını induksiya etməkdən daha geniş ola bilər.
Neyroinkişaf pozğunluqları olan xəstələrdə ishal və qəbizlik kimi mədə-bağırsaq simptomları çox rast gəlinir (Cao və b., 2021). Əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, autizm spektr pozğunluqları (ASB) olan xəstələrin mikrobiomu sağlam fərdlərin mikrobiomundan fərqlənir və bu da bağırsaq mikrobiota disbiozunun mövcudluğunu göstərir (Finegold və b., 2010). Eynilə, iltihabi bağırsaq xəstəlikləri, piylənmə, Alzheimer xəstəliyi və s. olan xəstələrin mikrobiom xüsusiyyətləri də sağlam fərdlərin mikrobiom xüsusiyyətlərindən fərqlənir (Turnbaugh və b., 2009; Vogt və b., 2017; Henke və b., 2019). Lakin, bu günə qədər bağırsaq mikrobiomu ilə nevroloji xəstəliklər və ya simptomlar arasında heç bir səbəb-nəticə əlaqəsi müəyyən edilməmişdir (Yap və b., 2021), baxmayaraq ki, bu xəstəlik vəziyyətlərinin bəzilərində bir neçə bakteriya növünün rol oynadığı düşünülür. Məsələn, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio və digər cinslər autizmli xəstələrin mikrobiotasında daha çox olur (Tomova və b., 2015; Golubeva və b., 2017; Cristiano və b., 2018; Zurita və b., 2020). Xüsusilə, bu cinslərin bəzilərinin üzv növlərinin PPA istehsalı ilə əlaqəli genlərə malik olduğu məlumdur (Reichardt və b., 2014; Yun və Lee, 2016; Zhang və b., 2019; Baur və Dürre, 2023). PPA-nın antimikrob xüsusiyyətləri nəzərə alınmaqla, onun bolluğunun artırılması PPA istehsal edən bakteriyaların böyüməsi üçün faydalı ola bilər (Jacobson və b., 2018). Beləliklə, PFA ilə zəngin bir mühit mədə-bağırsaq patogenləri də daxil olmaqla bağırsaq mikrobiotasında dəyişikliklərə səbəb ola bilər ki, bu da mədə-bağırsaq simptomlarına səbəb ola biləcək potensial amillər ola bilər.
Mikrobiom tədqiqatlarında əsas sual mikrob tərkibindəki fərqlərin əsas xəstəliklərin səbəbi və ya simptomu olub-olmamasıdır. Pəhriz, bağırsaq mikrobiomu və nevroloji xəstəliklər arasındakı mürəkkəb əlaqəni aydınlaşdırmaq üçün ilk addım pəhrizin mikrob tərkibinə təsirini qiymətləndirməkdir. Bu məqsədlə, PPA ilə zəngin və ya PPA çatışmazlığı olan pəhrizlə qidalanan siçanların nəslinin bağırsaq mikrobiomlarını müqayisə etmək üçün uzun oxunan metagenomik ardıcıllıqdan istifadə etdik. Nəsillər anaları ilə eyni pəhrizlə qidalanırdı. PPA ilə zəngin pəhrizin bağırsaq mikrob tərkibində və mikrob funksional yollarında, xüsusən də PPA metabolizması və/və ya PPA istehsalı ilə əlaqəli yollarda dəyişikliklərə səbəb olacağını fərz etdik.
Bu tədqiqatda Mərkəzi Florida Universitetinin İnstitusional Heyvan Baxımı və İstifadəsi Komitəsinin (UCF-IACUC) (Heyvan İstifadəsi İcazəsi Nömrəsi: PROTO202000002) təlimatlarına uyğun olaraq qliyaya xas GFAP promotorunun nəzarəti altında yaşıl flüoresan zülalı (GFP) həddindən artıq ifadə edən FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgen siçanlar (Jackson Laboratories) istifadə edilmişdir. Süddən ayırıldıqdan sonra siçanlar hər qəfəsdə hər cinsdən 1-5 siçan olmaqla fərdi olaraq qəfəslərdə saxlanılmışdır. Siçanlar ya təmizlənmiş nəzarət pəhrizi (modifikasiya olunmuş açıq etiketli standart pəhriz, 16 kkal% yağ), ya da natrium propionatla əlavə olunmuş pəhriz (modifikasiya olunmuş açıq etiketli standart pəhriz, 16 kkal% yağ, 5000 ppm natrium propionat ehtiva edən) ilə ad libitumda bəslənmişdir. İstifadə olunmuş natrium propionatın miqdarı ümumi qida çəkisi 5000 mq PFA/kq-a bərabər idi. Bu, qida qoruyucusu kimi istifadə üçün təsdiqlənmiş PPA-nın ən yüksək konsentrasiyasıdır. Bu tədqiqata hazırlaşmaq üçün ana siçanlara cütləşmədən 4 həftə əvvəl hər iki pəhriz verildi və ana siçanın hamiləliyi boyunca davam etdirildi. Bala siçanlar [22 siçan, 9 nəzarət (6 erkək, 3 dişi) və 13 PPA (4 erkək, 9 dişi)] süddən kəsildi və sonra ana siçanlar ilə eyni pəhrizdə 5 ay davam etdirildi. Bala siçanlar 5 aylıq yaşda qurban kəsildi və onların bağırsaq nəcis tərkibi toplanaraq əvvəlcə -20°C-də 1,5 ml mikrosentrifuq borularında saxlanıldı və sonra sahib DNT-si tükənənə və mikrob nuklein turşuları çıxarılana qədər -80°C-də dondurucuya köçürüldü.
Ev sahibi DNT-si modifikasiya olunmuş protokola uyğun olaraq çıxarıldı (Charalampous və b., 2019). Qısaca desək, nəcis tərkibi 500 µl InhibitEX-ə (Qiagen, Cat#/ID: 19593) köçürüldü və dondurulmuş şəkildə saxlanıldı. Hər ekstraksiya üçün maksimum 1-2 nəcis qranulu emal edin. Daha sonra nəcis tərkibi boru içərisindəki plastik pestle istifadə edərək suspenziya əmələ gətirmək üçün mexaniki olaraq homogenləşdirildi. Nümunələri 10.000 RCF-də 5 dəqiqə və ya nümunələr qranullaşana qədər santrifüj edin, sonra supernatantı sorub qranulu 250 µl 1× PBS-də yenidən suspenziya edin. Eukaryotik hüceyrə membranlarını yumşaltmaq üçün nümunəyə yuyucu vasitə kimi 250 µl 4,4% saponin məhlulu (TCI, məhsul nömrəsi S0019) əlavə edin. Nümunələr hamar olana qədər yavaşca qarışdırıldı və otaq temperaturunda 10 dəqiqə inkubasiya edildi. Daha sonra, ökaryotik hüceyrələri parçalamaq üçün nümunəyə 350 μl nukleazasız su əlavə edildi, 30 saniyə inkubasiya edildi və sonra 12 μl 5 M NaCl əlavə edildi. Daha sonra nümunələr 6000 RCF-də 5 dəqiqə santrifüj edildi. Supernatantı aspirasiya edin və qranulu 100 μl 1X PBS-də yenidən suspenziya edin. Sahib DNT-ni çıxarmaq üçün 100 μl HL-SAN buferi (12.8568 q NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nukleazasız su) və 10 μl HL-SAN fermenti (ArticZymes P/N 70910-202) əlavə edin. Nümunələr pipetləmə yolu ilə yaxşıca qarışdırıldı və Eppendorf™ ThermoMixer C cihazında 37°C-də 30 dəqiqə ərzində 800 dövr/dəq sürətlə inkubasiya edildi. İnkubasiyadan sonra 6000 RCF-də 3 dəqiqə ərzində santrifüj edildi və iki dəfə 800 µl və 1000 µl 1X PBS ilə yuyuldu. Sonda qranul 100 µl 1X PBS-də yenidən suspenziya edildi.
Ümumi bakterial DNT, New England Biolabs Monarch Genomic DNT Təmizləmə Dəsti (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) istifadə edilərək təcrid edilmişdir. Dəstlə birlikdə verilən standart əməliyyat proseduru bir qədər dəyişdirilmişdir. Son elusiya üçün əməliyyatdan əvvəl nukleazasız suyu 60°C-də inkubasiya edin və saxlayın. Hər nümunəyə 10 µl Proteinaz K və 3 µl RNase A əlavə edin. Sonra 100 µl Hüceyrə Lizis Buferi əlavə edin və yavaşca qarışdırın. Daha sonra nümunələr Eppendorf™ ThermoMixer C-də 56°C və 1400 dövr/dəqiqədə ən azı 1 saat və 3 saata qədər inkubasiya edildi. İnkubasiya edilmiş nümunələr 12000 RCF-də 3 dəqiqə santrifüj edildi və hər nümunədən çıxan supernatant 400 µL bağlayıcı məhlul olan ayrıca 1,5 ml mikrosantrifüj borusuna köçürüldü. Daha sonra borular 1 saniyəlik fasilələrlə 5-10 saniyə ərzində impulsla vorteks edildi. Hər nümunənin bütün maye tərkibini (təxminən 600–700 µL) axınlı toplama borusuna yerləşdirilmiş filtr kartricinə köçürün. Borular ilkin DNT bağlanmasına imkan vermək üçün 1000 RCF-də 3 dəqiqə santrifüq edildi və sonra qalıq mayeni çıxarmaq üçün 12000 RCF-də 1 dəqiqə santrifüq edildi. Nümunə sütunu yeni bir toplama borusuna köçürüldü və sonra iki dəfə yuyuldu. İlk yuma üçün hər boruya 500 µL yuma buferi əlavə edin. Borunu 3-5 dəfə çevirin və sonra 12000 RCF-də 1 dəqiqə santrifüq edin. Toplama borusundan mayeni atın və filtr kartricini eyni toplama borusuna geri qoyun. İkinci yuma üçün tərsinə çevirmədən filtrə 500 µL yuma buferi əlavə edin. Nümunələr 12000 RCF-də 1 dəqiqə santrifüq edildi. Filtri 1,5 ml LoBind® borusuna köçürün və üzərinə 100 µL əvvəlcədən qızdırılmış nukleazasız su əlavə edin. Filtrlər otaq temperaturunda 1 dəqiqə inkubasiya edildi və sonra 12000 RCF-də 1 dəqiqə santrifüj edildi. Elusiya edilmiş DNT -80°C-də saxlanıldı.
DNT konsentrasiyası Qubit™ 4.0 Flüorometrindən istifadə edilərək ölçülmüşdür. DNT istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Qubit™ 1X dsDNA Yüksək Həssaslıq Dəsti (Kat. № Q33231) istifadə edilərək hazırlanmışdır. DNT fraqmentinin uzunluğunun paylanması Aglient™ 4150 və ya 4200 TapeStation istifadə edilərək ölçülmüşdür. DNT Agilent™ Genom DNT Reagentləri (Kat. № 5067-5366) və Genom DNT Ekran Tape (Kat. № 5067-5365) istifadə edilərək hazırlanmışdır. Kitabxananın hazırlanması istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Sürətli PCR Barkodlaşdırma Dəsti (SQK-RPB004) istifadə edilərək həyata keçirilmişdir. DNT, Min106D axın hüceyrəsi (R 9.4.1) olan ONT GridION™ Mk1 sekvenserindən istifadə edilərək ardıcıllıqla təyin edilmişdir. Ardıcıllıq parametrləri aşağıdakılar idi: yüksək dəqiqlikli baza çağırışı, minimum q dəyəri 9, barkod quraşdırılması və barkod kəsimi. Nümunələr 72 saat ərzində ardıcıllıqla yoxlanılmış, bundan sonra baza zəng məlumatları sonrakı emal və təhlil üçün təqdim edilmişdir.
Bioinformatika emalı əvvəllər təsvir edilmiş metodlardan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (Greenman və b., 2024). Ardıcıllıqla əldə edilən FASTQ faylları hər nümunə üçün qovluqlara bölünmüşdür. Bioinformatika təhlilindən əvvəl məlumatlar aşağıdakı boru kəməri ilə işlənmişdir: əvvəlcə nümunələrin FASTQ faylları tək bir FASTQ faylına birləşdirilmişdir. Daha sonra, 1000 bp-dən qısa oxunuşlar Filtlong v. 0.2.1 istifadə edilərək süzülmüşdür və yeganə parametr dəyişdirildikdə –min_length 1000 olmuşdur (Wick, 2024). Əlavə süzülmədən əvvəl, oxunuş keyfiyyəti NanoPlot v. 1.41.3 istifadə edilərək aşağıdakı parametrlərlə idarə edilmişdir: –fastq –plots dot –N50 -o
Taksonomik təsnifat üçün oxunan və yığılmış kontiqlər Kraken2 v. 2.1.2 (Wood və b., 2019) istifadə edilərək təsnif edilmişdir. Oxunan və yığılanlar üçün müvafiq olaraq hesabatlar və çıxış faylları yaradın. Oxunan və yığılanları təhlil etmək üçün –use-names seçimindən istifadə edin. Oxunan seqmentlər üçün –gzip-sıxılmış və –qoşalaşdırılmış seçimlər göstərilmişdir. Metagenomlarda taksonların nisbi bolluğu Bracken v. 2.8 (Lu və b., 2017) istifadə edilərək qiymətləndirilmişdir. Əvvəlcə aşağıdakı parametrlərlə bracken-build istifadə edərək 1000 bazadan ibarət kmer verilənlər bazası yaratdıq: -d
Gen annotasiyası və nisbi bolluğun qiymətləndirilməsi Maranga və digərləri tərəfindən təsvir edilən protokolun dəyişdirilmiş versiyasından istifadə etməklə aparılmışdır (Maranga və digərləri, 2023). Əvvəlcə, 500 bp-dən qısa kontiqlər SeqKit v. 2.5.1 (Shen və digərləri, 2016) istifadə edərək bütün yığımlardan çıxarılmışdır. Seçilmiş yığımlar daha sonra pan-metagenoma birləşdirilmişdir. Açıq oxu çərçivələri (ORF) aşağıdakı parametrlərlə Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3-ün paralel versiyası) istifadə edərək müəyyən edilmişdir: -d
Genlər əvvəlcə eggNOG tərəfindən təyin edilmiş Genlər və Genomlar Ensiklopediyasının (KEGG) ortolog (KO) identifikatorlarına əsasən qruplaşdırıldı. Nokautu olmayan və ya çoxlu nokautu olan genlər təhlildən əvvəl çıxarıldı. Daha sonra nümunə başına hər KO-nun orta bolluğu hesablandı və statistik təhlil aparıldı. PPA metabolizması genləri, KEGG-yə görə propionat metabolizmasındakı rolu göstərən KEGG_Pathway sütununda ko00640 sətri təyin edilmiş istənilən gen kimi müəyyən edildi. PPA istehsalı ilə əlaqəli olaraq təyin olunan genlər Əlavə Cədvəl 1-də sadalanmışdır (Reichardt və b., 2014; Yang və b., 2017). Hər nümunə tipində əhəmiyyətli dərəcədə daha çox olan PPA metabolizması və istehsal genlərini müəyyən etmək üçün permutasiya testləri aparıldı. Təhlil edilən hər bir gen üçün min permutasiya aparıldı. Statistik əhəmiyyəti müəyyən etmək üçün 0,05 p-dəyəri kəsişmə nöqtəsi kimi istifadə edildi. Klaster daxilindəki nümayəndə genlərin annotasiyalarına əsasən klaster daxilindəki fərdi genlərə funksional annotasiyalar təyin edildi. PPA metabolizması və/və ya PPA istehsalı ilə əlaqəli taksonlar, eggNOG istifadə edərək funksional annotasiya zamanı saxlanılan eyni contig ID-ləri ilə Kraken2 çıxış fayllarında contig ID-lərini uyğunlaşdırmaqla müəyyən edilə bilər. Əhəmiyyət testi əvvəllər təsvir edilən Mann-Whitney U testi istifadə edilərək aparılmışdır. Çoxsaylı testlər üçün düzəliş Benjamini-Hochberg proseduru istifadə edilərək aparılmışdır. Statistik əhəmiyyəti müəyyən etmək üçün ≤ 0.05 p-dəyəri son hədd kimi istifadə edilmişdir.
Siçanların bağırsaq mikrobiomunun müxtəlifliyi Simpson müxtəliflik indeksi istifadə edilərək qiymətləndirilmişdir. Nəzarət və PPA nümunələri arasında cins və növ müxtəlifliyi baxımından heç bir əhəmiyyətli fərq müşahidə edilməmişdir (cins üçün p-dəyəri: 0,18, növ üçün p-dəyəri: 0,16) (Şəkil 1). Daha sonra mikrob tərkibi əsas komponent təhlili (PCA) istifadə edilərək müqayisə edilmişdir. Şəkil 2-də nümunələrin filalarına görə klasterləşməsi göstərilir ki, bu da PPA və nəzarət nümunələri arasında mikrobiomların növ tərkibində fərqlərin olduğunu göstərir. Bu klasterləşmə cins səviyyəsində daha az nəzərə çarpırdı və bu da PPA-nın müəyyən bakteriyalara təsir etdiyini göstərir (Əlavə Şəkil 1).
Şəkil 1. Cinslərin alfa müxtəlifliyi və siçan bağırsağı mikrobiomunun növ tərkibi. PPA və nəzarət nümunələrində (A) və (B) cinslərinin Simpson müxtəliflik indekslərini göstərən qutu qrafikləri. Əhəmiyyət Mann-Whitney U testi ilə müəyyən edilmiş və Benjamini-Hochberg proseduru ilə çoxsaylı korreksiya aparılmışdır. ns, p-dəyəri əhəmiyyətli deyildi (p>0.05).
Şəkil 2. Siçan bağırsağı mikrobiom tərkibinin növ səviyyəsində əsas komponent analizinin nəticələri. Əsas komponent analiz qrafiki nümunələrin ilk iki əsas komponenti üzrə paylanmasını göstərir. Rənglər nümunə növünü göstərir: PPA-ya məruz qalan siçanlar bənövşəyi, nəzarət siçanları isə sarıdır. Əsas komponentlər 1 və 2 müvafiq olaraq x və y oxu üzərində qrafik şəklində göstərilir və izah edilən variasiya nisbəti kimi ifadə olunur.
RLE transformasiya olunmuş say məlumatlarından istifadə edərək, nəzarət və PPA siçanlarında median Bacteroidetes/Bacilli nisbətində əhəmiyyətli bir azalma müşahidə edildi (nəzarət: 9.66, PPA: 3.02; p-dəyəri = 0.0011). Bu fərq, nəzarət qrupu ilə müqayisədə PPA siçanlarında Bacteroidetes-in daha yüksək bolluğu ilə əlaqədardır, baxmayaraq ki, fərq əhəmiyyətli deyildi (nəzarət orta CLR: 5.51, PPA orta CLR: 6.62; p-dəyəri = 0.054), Bacteroidetes bolluğu isə oxşar idi (nəzarət orta CLR: 7.76, PPA orta CLR: 7.60; p-dəyəri = 0.18).
Bağırsaq mikrobiomunun taksonomik üzvlərinin bolluğunun təhlili göstərdi ki, 1 filum və 77 növ PPA və nəzarət nümunələri arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənir (Əlavə Cədvəl 2). PPA nümunələrində 59 növün bolluğu nəzarət nümunələrindəkindən xeyli yüksək, nəzarət nümunələrində isə yalnız 16 növün bolluğu PPA nümunələrindəkindən daha yüksək idi (Şəkil 3).
Şəkil 3. PPA və nəzarət siçanlarının bağırsaq mikrobiomunda taksonların diferensial bolluğu. Vulkan qrafikləri PPA və nəzarət nümunələri arasında cinslərin (A) və ya növlərin (B) bolluğunda fərqlər göstərir. Boz nöqtələr taksonların bolluğunda əhəmiyyətli bir fərq olmadığını göstərir. Rəngli nöqtələr bolluqda əhəmiyyətli fərqləri göstərir (p-dəyəri ≤ 0.05). Nümunə növləri arasında bolluqda ən böyük fərqlərə malik ilk 20 takson müvafiq olaraq qırmızı və açıq mavi (nəzarət və PPA nümunələri) rənglərdə göstərilir. Sarı və bənövşəyi nöqtələr nəzarət və ya PPA nümunələrində nəzarətə nisbətən ən azı 2,7 dəfə çox idi. Qara nöqtələr orta CLR fərqləri -1 ilə 1 arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bolluqlara malik taksonları təmsil edir. P dəyərləri Mann-Whitney U testi istifadə edilərək hesablanmış və Benjamini-Hochberg proseduru istifadə edilərək çoxsaylı testlər üçün düzəldilmişdir. Qalın orta CLR fərqləri bolluqda əhəmiyyətli fərqləri göstərir.
Bağırsaq mikrob tərkibini təhlil etdikdən sonra mikrobiomun funksional annotasiyası aparıldı. Aşağı keyfiyyətli genləri süzgəcdən keçirdikdən sonra bütün nümunələrdə ümumilikdə 378.355 unikal gen müəyyən edildi. Bu genlərin transformasiya olunmuş bolluğu əsas komponent təhlili (PCA) üçün istifadə edildi və nəticələr funksional profillərinə əsasən nümunə növlərinin yüksək dərəcədə klasterləşməsini göstərdi (Şəkil 4).
Şəkil 4. Siçan bağırsaq mikrobiomunun funksional profilindən istifadə edərək PCA nəticələri. PCA qrafiki nümunələrin ilk iki əsas komponenti üzrə paylanmasını göstərir. Rənglər nümunə növünü göstərir: PPA-ya məruz qalan siçanlar bənövşəyi, nəzarət siçanları isə sarıdır. Əsas komponentlər 1 və 2 müvafiq olaraq x və y oxu üzərində qrafik şəklində göstərilir və izah edilən dispersiya nisbəti kimi ifadə olunur.
Daha sonra müxtəlif nümunə növlərində KEGG nokautlarının bolluğunu araşdırdıq. Cəmi 3648 unikal nokaut müəyyən edildi, bunlardan 196-sı nəzarət nümunələrində, 106-sı isə PPA nümunələrində daha çox idi (Şəkil 5). Nəzarət nümunələrində cəmi 145 gen, PPA nümunələrində isə əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bolluqlarla 61 gen aşkar edildi. Lipid və aminoşəkər metabolizması ilə əlaqəli yollar PPA nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə daha zəngin idi (Əlavə Cədvəl 3). Azot metabolizması və kükürd relay sistemləri ilə əlaqəli yollar nəzarət nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə daha zəngin idi (Əlavə Cədvəl 3). Aminoşəkər/nukleotid metabolizması (ko:K21279) və inozitol fosfat metabolizması (ko:K07291) ilə əlaqəli genlərin bolluğu PPA nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (Şəkil 5). Kontrol nümunələrində benzoat metabolizması (ko:K22270), azot metabolizması (ko:K00368) və qlikoliz/qlükoneogenez (ko:K00131) ilə əlaqəli əhəmiyyətli dərəcədə daha çox gen var idi (Şəkil 5).
Şəkil 5. PPA və nəzarət siçanlarının bağırsaq mikrobiomundakı KO-ların diferensial bolluğu. Vulkan qrafiki funksional qrupların (KO) bolluğundakı fərqləri təsvir edir. Boz nöqtələr, nümunə növləri arasında bolluğu əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməyən KO-ları göstərir (p-dəyəri > 0,05). Rəngli nöqtələr bolluqda əhəmiyyətli fərqləri göstərir (p-dəyəri ≤ 0,05). Nümunə növləri arasında bolluqda ən böyük fərqlərə malik 20 KO, müvafiq olaraq nəzarət və PPA nümunələrinə uyğun olaraq qırmızı və açıq mavi rənglərlə göstərilir. Sarı və bənövşəyi nöqtələr, müvafiq olaraq nəzarət və PPA nümunələrində ən azı 2,7 dəfə çox olan KO-ları göstərir. Qara nöqtələr, orta CLR fərqləri -1 ilə 1 arasında olan əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bolluqlara malik KO-ları göstərir. P dəyərləri Mann-Whitney U testi istifadə edilərək hesablanmış və Benjamini-Hochberg proseduru istifadə edilərək çoxsaylı müqayisələr üçün düzəldilmişdir. NaN, KO-nun KEGG-də bir yola aid olmadığını göstərir. Qalın orta CLR fərq dəyərləri bolluqda əhəmiyyətli fərqləri göstərir. Sadalanan KO-ların aid olduğu yollar haqqında ətraflı məlumat üçün Əlavə Cədvəl 3-ə baxın.
Qeyd olunmuş genlər arasında 1601 genin nümunə növləri arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bolluqları var idi (p ≤ 0.05), hər bir gen ən azı 2.7 dəfə çox idi. Bu genlərdən 4-ü nəzarət nümunələrində, 1597-si isə PPA nümunələrində daha çox idi. PPA antimikrob xüsusiyyətlərinə malik olduğundan, nümunə növləri arasında PPA metabolizması və istehsal genlərinin bolluqlarını araşdırdıq. 1332 PPA metabolizması ilə əlaqəli genlər arasında 27 gen nəzarət nümunələrində, 12-si isə PPA nümunələrində daha çox idi. 223 PPA istehsalı ilə əlaqəli genlər arasında 1 gen PPA nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə daha çox idi. Şəkil 6A, PPA metabolizmasında iştirak edən genlərin daha çox bolluğunu, nəzarət nümunələrində daha çox bolluğu və böyük effekt ölçülərini daha da nümayiş etdirir, Şəkil 6B isə PPA nümunələrində daha çox bolluğu müşahidə edilən fərdi genləri vurğulayır.
Şəkil 6. Siçan bağırsağı mikrobiomunda PPA ilə əlaqəli genlərin diferensial bolluğu. Vulkan qrafikləri PPA metabolizması (A) və PPA istehsalı (B) ilə əlaqəli genlərin bolluğundakı fərqləri təsvir edir. Boz nöqtələr, bolluğu nümunə növləri arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməyən genləri göstərir (p-dəyəri > 0,05). Rəngli nöqtələr bolluqda əhəmiyyətli fərqləri göstərir (p-dəyəri ≤ 0,05). Bolluqda ən böyük fərqlərə malik 20 gen müvafiq olaraq qırmızı və açıq mavi rənglərdə (nəzarət və PPA nümunələri) göstərilir. Sarı və bənövşəyi nöqtələrin bolluğu nəzarət və PPA nümunələrində nəzarət nümunələrinə nisbətən ən azı 2,7 dəfə çox idi. Qara nöqtələr, orta CLR fərqləri -1 ilə 1 arasında olmaqla, əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bolluqlara malik genləri təmsil edir. P dəyərləri Mann-Whitney U testi istifadə edilərək hesablanmış və Benjamini-Hochberg proseduru istifadə edilərək çoxsaylı müqayisələr üçün düzəldilmişdir. Genlər artıq olmayan gen kataloqundakı təmsilçi genlərə uyğundur. Gen adları KO genini bildirən KEGG simvolundan ibarətdir. Qalın orta CLR fərqləri əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bolluqları göstərir. Tire (-) KEGG verilənlər bazasında gen üçün heç bir simvolun olmadığını göstərir.
PPA metabolizması və/və ya istehsalı ilə əlaqəli genlərə malik taksonlar, kontiqlərin taksonomik kimliyini genin kontiq ID-si ilə uyğunlaşdırmaqla müəyyən edilmişdir. Cins səviyyəsində 130 cinsdə PPA metabolizması ilə əlaqəli genlər, 61 cinsdə isə PPA istehsalı ilə əlaqəli genlər aşkar edilmişdir (Əlavə Cədvəl 4). Lakin, heç bir cinsdə bolluqda əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edilməmişdir (p > 0.05).
Növ səviyyəsində 144 bakteriya növünün PPA metabolizması ilə əlaqəli genlərə, 68 bakteriya növünün isə PPA istehsalı ilə əlaqəli genlərə malik olduğu aşkar edilmişdir (Əlavə Cədvəl 5). PPA metabolizatorları arasında səkkiz bakteriya nümunə növləri arasında bolluqda əhəmiyyətli artımlar göstərmiş və hamısı təsirdə əhəmiyyətli dəyişikliklər göstərmişdir (Əlavə Cədvəl 6). Bolluqda əhəmiyyətli fərqlərə malik bütün müəyyən edilmiş PPA metabolizatorları PPA nümunələrində daha çox olmuşdur. Növ səviyyəli təsnifat nümunə növləri arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməyən cinslərin nümayəndələrini, o cümlədən bir neçə Bacteroides və Ruminococcus növlərini, eləcə də Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus və Alcaligenes polymorpha növlərini aşkar etmişdir. PPA istehsal edən bakteriyalar arasında dörd bakteriya nümunə növləri arasında bolluqda əhəmiyyətli fərqlər göstərmişdir. Bolluqda əhəmiyyətli fərqlərə malik növlərə Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis və Ruminococcus bovis daxildir.
Bu tədqiqatda biz PPA-nın siçanların bağırsaq mikrobiotasına təsirini araşdırdıq. PPA müəyyən növlər tərəfindən istehsal olunduğu, digər növlər tərəfindən qida mənbəyi kimi istifadə edildiyi və ya antimikrob təsirləri olduğu üçün bakteriyalarda fərqli reaksiyalar yarada bilər. Buna görə də, onun qida əlavəsi vasitəsilə bağırsaq mühitinə əlavə edilməsi tolerantlıqdan, həssaslıqdan və qida mənbəyi kimi istifadə etmək qabiliyyətindən asılı olaraq fərqli təsirlərə malik ola bilər. Həssas bakteriya növləri aradan qaldırıla və PPA-ya daha davamlı olan və ya qida mənbəyi kimi istifadə edə bilən növlərlə əvəz edilə bilər ki, bu da bağırsaq mikrobiotasının tərkibində dəyişikliklərə səbəb olur. Nəticələrimiz mikrob tərkibində əhəmiyyətli fərqlər aşkar etdi, lakin ümumi mikrob müxtəlifliyinə heç bir təsir göstərmədi. Ən böyük təsirlər növ səviyyəsində müşahidə edildi, PPA və nəzarət nümunələri arasında bolluğunda əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənən 70-dən çox takson müşahidə edildi (Əlavə Cədvəl 2). PPA-ya məruz qalan nümunələrin tərkibinin daha da qiymətləndirilməsi, məruz qalmamış nümunələrlə müqayisədə mikrob növlərinin daha çox heterojenliyini aşkar etdi ki, bu da PPA-nın bakteriyaların böyümə xüsusiyyətlərini artıra və PPA ilə zəngin mühitlərdə yaşaya bilən bakteriya populyasiyalarını məhdudlaşdıra biləcəyini göstərir. Beləliklə, PPA bağırsaq mikrobiota müxtəlifliyinin geniş yayılmış şəkildə pozulmasına səbəb olmaq əvəzinə, selektiv olaraq dəyişikliklərə səbəb ola bilər.
PPA kimi qida qoruyucularının əvvəllər ümumi müxtəlifliyə təsir etmədən bağırsaq mikrobiom komponentlərinin bolluğunu dəyişdirdiyi göstərilmişdir (Nagpal və b., 2021). Burada, PPA-ya məruz qalan siçanlarda əhəmiyyətli dərəcədə zəngin olan Bacteroidetes filumu (əvvəllər Bacteroidetes kimi tanınırdı) daxilindəki Bacteroidetes növləri arasında ən təəccüblü fərqləri müşahidə etdik. Bacteroides növlərinin bolluğunun artması seliyin parçalanmasının artması ilə əlaqələndirilir ki, bu da infeksiya riskini artıra və iltihabı təşviq edə bilər (Cornick və b., 2015; Desai və b., 2016; Penzol və b., 2019). Bir tədqiqatda Bacteroides fragilis ilə müalicə olunan yeni doğulmuş erkək siçanların autizm spektr pozğunluğunu (ASD) xatırladan sosial davranışlar nümayiş etdirdiyi aşkar edilmişdir (Carmel və b., 2023) və digər tədqiqatlar Bacteroides növlərinin immun fəaliyyətini dəyişdirə və otoimmün iltihabi kardiyomiyopatiyaya səbəb ola biləcəyi göstərilmişdir (Gil-Cruz və b., 2019). Ruminococcus, Prevotella və Parabacteroides cinsinə aid növlər də PPA-ya məruz qalan siçanlarda əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Coretti və b., 2018). Müəyyən Ruminococcus növləri proiltihablı sitokinlərin istehsalı vasitəsilə Kron xəstəliyi kimi xəstəliklərlə əlaqələndirilir (Henke və b., 2019), Prevotella humani kimi Prevotella növləri isə hipertoniya və insulinə həssaslıq kimi metabolik xəstəliklərlə əlaqələndirilir (Pedersen və b., 2016; Li və b., 2017). Nəhayət, Bacteroidetes növlərinin ümumi bolluğu daha yüksək olduğuna görə Bacteroidetes-in (əvvəllər Firmicutes kimi tanınırdı) Bacteroidetes-ə nisbətinin PPA-ya məruz qalan siçanlarda nəzarət siçanlarına nisbətən xeyli aşağı olduğunu aşkar etdik. Bu nisbət əvvəllər bağırsaq homeostazının vacib bir göstəricisi olduğu göstərilmişdir və bu nisbətdəki pozğunluqlar iltihabi bağırsaq xəstəlikləri də daxil olmaqla müxtəlif xəstəlik vəziyyətləri ilə əlaqələndirilmişdir (Turpin və b., 2016; Takezawa və b., 2021; An və b., 2023). Ümumilikdə, Bacteroidetes filumunun növləri yüksək pəhriz PPA-sından ən çox təsirlənir. Bu, PPA-ya qarşı daha yüksək tolerantlıq və ya PPA-nı enerji mənbəyi kimi istifadə etmək qabiliyyəti ilə əlaqəli ola bilər ki, bu da ən azı bir növ, Hoylesella enocea üçün doğru olduğu göstərilmişdir (Hitch və b., 2022). Alternativ olaraq, ananın PPA-ya məruz qalması siçan nəslinin bağırsağını Bacteroidetes kolonizasiyasına daha həssas etməklə dölün inkişafını artıra bilər; lakin, tədqiqat dizaynımız belə bir qiymətləndirməyə imkan vermədi.
Metagenomik məzmun qiymətləndirməsi PPA metabolizması və istehsalı ilə əlaqəli genlərin bolluğunda əhəmiyyətli fərqlər aşkar etdi, PPA-ya məruz qalan siçanlar PPA istehsalından məsul olan daha yüksək gen bolluğu nümayiş etdirir, PPA-ya məruz qalmayan siçanlar isə PAA metabolizmasından məsul olan daha yüksək gen bolluğu nümayiş etdirir (Şəkil 6). Bu nəticələr göstərir ki, PPA-nın mikrob tərkibinə təsiri yalnız onun istifadəsi ilə bağlı olmaya bilər, əks halda PPA metabolizması ilə əlaqəli genlərin bolluğu PPA-ya məruz qalan siçanların bağırsaq mikrobiomunda daha yüksək bolluq göstərməli idi. Bir izah PPA-nın bakteriyaların bolluğunu bakteriyalar tərəfindən qida maddəsi kimi istifadə edilməsindən daha çox, əsasən antimikrob təsirləri vasitəsilə vasitəçilik etməsidir. Əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, PPA Salmonella Typhimurium-un böyüməsini dozadan asılı olaraq maneə törədir (Jacobson və digərləri, 2018). PPA-nın daha yüksək konsentrasiyalarına məruz qalma, onun antimikrob xüsusiyyətlərinə davamlı olan və mütləq metabolizə edə və ya istehsal edə bilməyən bakteriyalar üçün seçim edə bilər. Məsələn, bir neçə Parabacteroides növü PPA nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə daha yüksək bolluq göstərdi, lakin PPA metabolizması və ya istehsalı ilə əlaqəli heç bir gen aşkar edilmədi (Əlavə Cədvəllər 2, 4 və 5). Bundan əlavə, fermentasiya yan məhsulu kimi PPA istehsalı müxtəlif bakteriyalar arasında geniş yayılmışdır (Gonzalez-Garcia və b., 2017). Daha yüksək bakteriya müxtəlifliyi nəzarət nümunələrində PPA metabolizması ilə əlaqəli genlərin daha yüksək bolluğunun səbəbi ola bilər (Averina və b., 2020). Bundan əlavə, 1332 gendən yalnız 27-sinin (2.14%) yalnız PPA metabolizması ilə əlaqəli genlər olduğu proqnozlaşdırıldı. PPA metabolizması ilə əlaqəli bir çox gen digər metabolik yollarda da iştirak edir. Bu, PPA metabolizmasında iştirak edən genlərin bolluğunun nəzarət nümunələrində daha yüksək olduğunu göstərir; bu genlər PPA-nın yan məhsul kimi istifadəsinə və ya əmələ gəlməsinə səbəb olmayan yollarda fəaliyyət göstərə bilər. Bu halda, PPA generasiyası ilə əlaqəli yalnız bir gen nümunə növləri arasında bolluqda əhəmiyyətli fərqlər göstərdi. PPA metabolizması ilə əlaqəli genlərdən fərqli olaraq, PPA istehsalı üçün marker genlər seçilmişdir, çünki onlar PPA istehsalı üçün bakteriya yolunda birbaşa iştirak edirlər. PPA-ya məruz qalan siçanlarda bütün növlərin PPA istehsal etmək üçün bolluğu və qabiliyyəti əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır. Bu, PPA-ların PPA istehsalçılarını seçəcəyi və buna görə də PPA istehsal qabiliyyətinin artacağını proqnozlaşdıracağı proqnozunu dəstəkləyir. Lakin, gen bolluğu mütləq gen ifadəsi ilə əlaqəli deyil; beləliklə, PPA metabolizması ilə əlaqəli genlərin bolluğu nəzarət nümunələrində daha yüksək olsa da, ifadə nisbəti fərqli ola bilər (Shi və digərləri, 2014). PPA istehsal edən genlərin yayılması ilə PPA istehsalı arasındakı əlaqəni təsdiqləmək üçün PPA istehsalında iştirak edən genlərin ifadəsinin tədqiqatlarına ehtiyac var.
PPA və nəzarət metagenomlarının funksional annotasiyası bəzi fərqləri aşkar etdi. Gen tərkibinin PCA təhlili PPA və nəzarət nümunələri arasında diskret klasterlər aşkar etdi (Şəkil 5). Nümunə daxilində klasterləşdirmə, nəzarət gen tərkibinin daha müxtəlif olduğunu, PPA nümunələrinin isə bir-birinə qruplaşdığını göstərdi. Gen tərkibinə görə klasterləşdirmə növ tərkibinə görə klasterləşdirmə ilə müqayisə edilə bilərdi. Beləliklə, yol bolluğundakı fərqlər, onlardakı spesifik növlərin və ştammların bolluğundakı dəyişikliklərlə uyğun gəlir. PPA nümunələrində, əhəmiyyətli dərəcədə daha yüksək bolluğa malik iki yol aminoşəkər/nukleotid şəkər metabolizması (ko:K21279) və çoxlu lipid metabolizması yolları (ko:K00647, ko:K03801; Əlavə Cədvəl 3) ilə əlaqəli idi. ko:K21279 ilə əlaqəli genlərin PPA nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə daha çox növə malik cinslərdən biri olan Bacteroides cinsi ilə əlaqəli olduğu məlumdur. Bu ferment kapsul polisaxaridləri ifadə edərək immun reaksiyasından yayınmaq iqtidarındadır (Wang və digərləri, 2008). Bu, PPA-ya məruz qalan siçanlarda müşahidə olunan bakteroidlərin artmasına səbəb ola bilər. Bu, PPA mikrobiomunda müşahidə olunan yağ turşusu sintezinin artmasına səbəb olur. Bakteriyalar yağ turşuları istehsal etmək üçün FASIIko:K00647 (fabB) yolundan istifadə edir ki, bu da ev sahibinin metabolik yollarına təsir göstərə bilər (Yao və Rock, 2015; Johnson və b., 2020) və lipid metabolizmasındakı dəyişikliklər neyroinkişafda rol oynaya bilər (Yu və b., 2020). PPA nümunələrində artan bolluğu göstərən başqa bir yol steroid hormon biosintezi idi (ko:K12343). Bağırsaq mikrobiotasının hormon səviyyələrinə təsir etmək və hormonlardan təsirlənmək qabiliyyəti arasında tərs əlaqənin olduğuna dair getdikcə daha çox dəlil var, belə ki, yüksək steroid səviyyələri aşağı axın sağlamlıq nəticələrinə səbəb ola bilər (Tetel və b., 2018).
Bu tədqiqat məhdudiyyətlər və mülahizələr olmadan deyil. Əhəmiyyətli bir fərq, heyvanların fizioloji qiymətləndirmələrini aparmamağımızdır. Buna görə də, mikrobiomdakı dəyişikliklərin hər hansı bir xəstəliklə əlaqəli olub-olmadığı barədə birbaşa nəticə çıxarmaq mümkün deyil. Digər bir mülahizə isə, bu tədqiqatdakı siçanların anaları ilə eyni pəhrizlə qidalanmasıdır. Gələcək tədqiqatlar PPA ilə zəngin pəhrizdən PPA-sız pəhrizə keçidin onun mikrobioma təsirini yaxşılaşdırıb-yaxşılaşdırmadığını müəyyən edə bilər. Bir çox tədqiqatımız kimi, tədqiqatımızın da məhdudiyyətlərindən biri məhdud nümunə ölçüsüdür. Etibarlı nəticələr çıxarıla bilsə də, daha böyük nümunə ölçüsü nəticələri təhlil edərkən daha böyük statistik güc təmin edəcəkdir. Bağırsaq mikrobiomundakı dəyişikliklərlə hər hansı bir xəstəlik arasında əlaqə barədə nəticə çıxarmaqda da ehtiyatlıyıq (Yap və b., 2021). Yaş, cins və pəhriz də daxil olmaqla qarışıq amillər mikroorqanizmlərin tərkibinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərə bilər. Bu amillər bağırsaq mikrobiomunun mürəkkəb xəstəliklərlə əlaqəsi ilə bağlı ədəbiyyatda müşahidə olunan uyğunsuzluqları izah edə bilər (Johnson və b., 2019; Lagod və Naser, 2023). Məsələn, Bacteroidetes cinsinin üzvlərinin ASD olan heyvanlarda və insanlarda ya artdığı, ya da azaldığı göstərilmişdir (Angelis və b., 2013; Kushak və b., 2017). Eynilə, iltihabi bağırsaq xəstəlikləri olan xəstələrdə bağırsaq tərkibinin araşdırılması eyni taksonlarda həm artım, həm də azalma aşkar etmişdir (Walters və b., 2014; Forbes və b., 2018; Upadhyay və b., 2023). Cins qərəzliliyinin təsirini məhdudlaşdırmaq üçün cinslərin bərabər təmsil olunmasını təmin etməyə çalışdıq ki, fərqlər çox güman ki, pəhrizdən qaynaqlansın. Funksional annotasiyanın çətinliklərindən biri artıq gen ardıcıllıqlarının aradan qaldırılmasıdır. Gen klasterləşdirmə metodumuz 95% ardıcıllıq eyniliyi və 85% uzunluq oxşarlığı, eləcə də yalançı klasterləşməni aradan qaldırmaq üçün 90% uyğunlaşdırma əhatə dairəsi tələb edir. Lakin, bəzi hallarda eyni annotasiyalara malik COG-ləri (məsələn, MUT) müşahidə etdik (Şəkil 6). Bu ortologların fərqli olub-olmadığını, spesifik cinslərlə əlaqəli olub-olmadığını və ya bunun gen klasterləşdirmə yanaşmasının məhdudiyyəti olub-olmadığını müəyyən etmək üçün əlavə tədqiqatlar tələb olunur. Funksional annotasiyanın digər bir məhdudiyyəti potensial səhv təsnifatdır; bakterial mmdA geni propionat sintezində iştirak edən məlum bir fermentdir, lakin KEGG onu propionat metabolik yolu ilə əlaqələndirmir. Bunun əksinə olaraq, scpB və mmcD ortologları əlaqəlidir. Təyin olunmuş nokautları olmayan çox sayda gen, gen bolluğunu qiymətləndirərkən PPA ilə əlaqəli genləri müəyyən edə bilməməyə səbəb ola bilər. Gələcək tədqiqatlar bağırsaq mikrobiotasının funksional xüsusiyyətlərini daha dərindən anlamağa və gen ifadəsini potensial aşağı axın təsirləri ilə əlaqələndirməyə imkan verən metatranskriptom analizindən faydalanacaq. Xüsusi neyroinkişaf pozğunluqları və ya iltihabi bağırsaq xəstəliklərini əhatə edən tədqiqatlar üçün mikrobiom tərkibindəki dəyişiklikləri bu pozğunluqlarla əlaqələndirmək üçün heyvanların fizioloji və davranış qiymətləndirmələrinə ehtiyac var. Bağırsaq mikrobiomunu mikrobsuz siçanlara köçürən əlavə tədqiqatlar da mikrobiomun xəstəliyin səbəbi və ya xarakteristikası olub-olmadığını müəyyən etmək üçün faydalı olardı.
Xülasə, biz pəhriz PPA-nın bağırsaq mikrobiotasının tərkibini dəyişdirən amil kimi çıxış etdiyini nümayiş etdirdik. PPA, uzunmüddətli təsir zamanı normal bağırsaq florasının pozulmasına səbəb ola biləcək müxtəlif qidalarda geniş yayılmış FDA tərəfindən təsdiqlənmiş qoruyucu maddədir. Bir neçə bakteriyanın bolluğunda dəyişikliklər aşkar etdik ki, bu da PPA-nın bağırsaq mikrobiotasının tərkibinə təsir göstərə biləcəyini göstərir. Mikrobiotadakı dəyişikliklər müəyyən metabolik yolların səviyyəsində dəyişikliklərə səbəb ola bilər ki, bu da ev sahibi sağlamlığı ilə əlaqəli fizioloji dəyişikliklərə səbəb ola bilər. Pəhriz PPA-nın mikrob tərkibinə təsirinin disbioza və ya digər xəstəliklərə səbəb olub-olmadığını müəyyən etmək üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var. Bu tədqiqat PPA-nın bağırsaq tərkibinə təsirinin insan sağlamlığına necə təsir edə biləcəyi ilə bağlı gələcək tədqiqatların əsasını qoyur.
Bu tədqiqatda təqdim olunan məlumat dəstləri onlayn depolarda mövcuddur. Depo adı və giriş nömrəsi: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Bu heyvan tədqiqatı Mərkəzi Florida Universitetinin Heyvanlara Qayğı və İstifadə üzrə İnstitusional Komitəsi (UCF-IACUC) tərəfindən təsdiq edilmişdir (Heyvan İstifadəsi İcazəsi Nömrəsi: PROTO202000002). Bu tədqiqat yerli qanunlara, qaydalara və institusional tələblərə uyğundur.
NG: Konseptuallaşdırma, Məlumatların seçilməsi, Formal təhlil, Araşdırma, Metodologiya, Proqram təminatı, Vizuallaşdırma, Yazı (orijinal layihə), Yazı (nəzərdən keçirmə və redaktə). LA: Konseptuallaşdırma, Məlumatların seçilməsi, Metodologiya, Resurslar, Yazı (nəzərdən keçirmə və redaktə). SH: Formal təhlil, Proqram təminatı, Yazı (nəzərdən keçirmə və redaktə). SA: Araşdırma, Yazı (nəzərdən keçirmə və redaktə). Baş Hakim: Araşdırma, Yazı (nəzərdən keçirmə və redaktə). SN: Konseptuallaşdırma, Layihənin idarə edilməsi, Resurslar, Nəzarət, Yazı (nəzərdən keçirmə və redaktə). TA: Konseptuallaşdırma, Layihənin idarə edilməsi, Nəzarət, Yazı (nəzərdən keçirmə və redaktə).
Müəlliflər bu məqalənin tədqiqatı, müəllifliyi və/və ya dərci üçün heç bir maliyyə dəstəyi almadıqlarını bəyan etdilər.
Müəlliflər tədqiqatın potensial maraqların toqquşması kimi şərh edilə biləcək hər hansı kommersiya və ya maliyyə münasibətlərinin olmadığı şəraitdə aparıldığını bəyan edirlər. Bu, tətbiq olunmur.
Bu məqalədə ifadə olunan bütün fikirlər yalnız müəlliflərə məxsusdur və mütləq onların qurumlarının, naşirlərinin, redaktorlarının və ya rəyçilərinin fikirlərini əks etdirmir. Bu məqalədə qiymətləndirilən hər hansı məhsul və ya onların istehsalçıları tərəfindən irəli sürülən hər hansı iddia naşir tərəfindən təmin edilmir və ya təsdiqlənmir.
Bu məqalə üçün əlavə materialları onlayn olaraq tapa bilərsiniz: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propion turşusu autizm spektr pozğunluqlarında PTEN/AKT yolunu tənzimləyərək qlioz və neyroiltihabı induksiya edir. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Kompozisiya məlumatlarının statistik təhlili. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Döş xərçəngi üçün risk faktoru kimi Firmicutes/Bacteroidetes nisbəti. Jurnal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Ardıcıllıq sayma məlumatlarının diferensial ifadə təhlili. Nat Əvvəlki. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI və b. (2013). Başqa cür göstərilməyən autizm və geniş yayılmış inkişaf pozğunluğu olan uşaqlarda nəcis mikrobiotası və metabolom. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Autizm spektr pozğunluqları olan kiçik uşaqlarda bağırsaq mikrobiotasının bakterial neyrometabolik xüsusiyyətləri. Tibbi Mikrobiologiya Jurnalı 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiom insan orqanı kimi. Klinik Mikrobiologiya və İnfeksiya 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Propion turşusu istehsal edən bakteriyaların fiziologiyasına yeni baxışlar: Anaerotignum propionicum və Anaerotignum neopropionicum (əvvəllər Clostridium propionicum və Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Ananın qidalanması və dölün inkişafı. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., və Hochberg, J. (1995). Yalançı müsbət nəticənin idarə olunması: Çoxlu testlərə praktik və səmərəli yanaşma. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Yazı vaxtı: 18 aprel 2025