İmmunomodulyator metabolitlər şiş mikromühitinin (TME) əsas xüsusiyyətidir, lakin bir neçə istisna olmaqla, onların kimliyi əsasən naməlum olaraq qalır. Burada, bu fərqli TME bölmələrinin metabolomunu aşkar etmək üçün yüksək dərəcəli seroz karsinoma (HGSC) olan xəstələrin şişlərindən və assitlərindən şişləri və T hüceyrələrini təhlil etdik. Assitlər və şiş hüceyrələri geniş metabolit fərqlərinə malikdir. Assitlərlə müqayisədə, şişə infiltrasiya edən T hüceyrələri 1-metilnikotinamid (MNA) ilə əhəmiyyətli dərəcədə zəngindir. T hüceyrələrində MNA səviyyəsi yüksək olsa da, nikotinamid N-metiltransferaza (metil qruplarının S-adenosilmetionindən nikotinamidə ötürülməsini katalizləşdirən bir ferment) ifadəsi fibroblastlar və şiş hüceyrələri ilə məhdudlaşır. Funksional olaraq, MNA, T hüceyrələrini şişi təşviq edən sitokin şiş nekrozu faktoru alfa ifraz etməyə təşviq edir. Buna görə də, TME-dən əldə edilən MNA, T hüceyrələrinin immun tənzimlənməsinə töhfə verir və insan xərçənginin müalicəsi üçün potensial immunoterapiya hədəfini təmsil edir.
Şişdən əmələ gələn metabolitlər şiş əleyhinə immunitetə ​​dərin inhibitor təsir göstərə bilər və getdikcə daha çox dəlil onların xəstəliyin irəliləməsi üçün əsas hərəkətverici qüvvə kimi də xidmət edə biləcəyini göstərir (1). Warburg effektinə əlavə olaraq, son zamanlar şiş hüceyrələrinin metabolik vəziyyətini və onun şiş mikromühitinin (TME) immun vəziyyəti ilə əlaqəsini xarakterizə etmək üçün işlər görülməyə başlanmışdır. Siçan modelləri və insan T hüceyrələri üzərində aparılan tədqiqatlar göstərmişdir ki, qlütamin metabolizmi (2), oksidləşdirici metabolizm (3) və qlükoza metabolizmi (4) müxtəlif immun hüceyrə alt qruplarına müstəqil şəkildə təsir göstərə bilər. Bu yollardakı bir neçə metabolit T hüceyrələrinin şiş əleyhinə funksiyasını inhibə edir. Sübut edilmişdir ki, koenzim tetrahidrobiopterinin (BH4) blokadası T hüceyrələrinin proliferasiyasına zərər verə bilər və bədəndə BH4-ün artması CD4 və CD8 vasitəçiliyi ilə şiş əleyhinə immun cavabını gücləndirə bilər. Bundan əlavə, kinureninin immunosupressiv təsiri BH4-ün tətbiqi ilə xilas edilə bilər (5). İzositrat dehidrogenaza (IDH) mutant qlioblastomasında enantiometabolik (R)-2-hidroksiqlütaratın (R-2-HG) ifrazı T hüceyrələrinin aktivləşməsini, proliferasiyasını və sitoliz aktivliyini inhibə edir (6). Bu yaxınlarda qlikolizin yan məhsulu olan metilqlioksalın miyeloid mənşəli supressor hüceyrələr tərəfindən istehsal olunduğu və metilqlioksalın T hüceyrələrinə ötürülməsinin effektor T hüceyrələrinin funksiyasını inhibə edə biləcəyi göstərilmişdir. Müalicədə metilqlioksalın neytrallaşdırılması miyeloid mənşəli supressor hüceyrələrin (MDSC) fəaliyyətini aradan qaldıra və siçan modellərində nəzarət nöqtəsi blokadası terapiyasını sinergetik şəkildə gücləndirə bilər (7). Bu tədqiqatlar birlikdə TME-dən əldə edilən metabolitlərin T hüceyrələrinin funksiyasını və aktivliyini tənzimləməkdəki əsas rolunu vurğulayır.
Yumurtalıq xərçəngində T hüceyrə disfunksiyası geniş şəkildə bildirilmişdir (8). Bu, qismən hipoksiyaya xas olan metabolik xüsusiyyətlər və şiş damar sisteminin anormallığı ilə əlaqədardır (9), bu da qlükoza və triptofanın süd turşusu və kinurenin kimi yan məhsullara çevrilməsinə səbəb olur. Həddindən artıq hüceyrə xarici laktat interferon-γ (IFN-γ) istehsalını azaldır və miyelosupressiv alt qrupların differensiasiyasını sürətləndirir (10, 11). Triptofanın istehlakı birbaşa T hüceyrə proliferasiyasını inhibə edir və T hüceyrə reseptor siqnalını inhibə edir (12-14). Bu müşahidələrə baxmayaraq, immun metabolizması ilə bağlı bir çox iş in vitro T hüceyrə kulturasında optimallaşdırılmış mühitlərdən istifadə edilməklə və ya in vivo homoloji siçan modelləri ilə məhdudlaşdırılmaqla aparılmışdır ki, bunların heç biri insan xərçənglərinin və fizioloji makro və mikro mühitin heterojenliyini tam əks etdirmir.
Yumurtalıq xərçənginin ümumi bir xüsusiyyəti peritoneal yayılma və assitlərin görünüşüdür. Assitlərdə hüceyrə mayesinin toplanması xəstəliyin irəliləməsi və zəif proqnozla əlaqələndirilir (15). Məlumatlara görə, bu unikal bölmə hipoksikdir, damar endotel böyümə faktorunun (VEGF) və indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO) yüksək səviyyədədir və T tənzimləyici hüceyrələri və miyeloid inhibitor hüceyrələri tərəfindən infiltrasiya olunur (15-18). Assitlərin metabolik mühiti şişin özündən fərqli ola bilər, buna görə də peritoneal boşluqda T hüceyrələrinin yenidən proqramlaşdırılması aydın deyil. Bundan əlavə, şiş mühitində mövcud olan assitlər və metabolitlər arasındakı əsas fərqlər və heterojenlik immun hüceyrələrinin infiltrasiyasına və şişlər üzərində funksiyasına mane ola bilər və əlavə tədqiqatlara ehtiyac var.
Bu problemləri həll etmək üçün müxtəlif hüceyrə növlərini (CD4 + və CD8 + T hüceyrələri daxil olmaqla), eləcə də şişlər arasında öyrənmək üçün həssas hüceyrə ayrılması və maye xromatoqrafiya tandem kütlə spektrometriyası (LC-MS/MS) metodu hazırladıq. Onun metabolitləri xəstənin eyni assit və şiş mühitindəki hüceyrələri əhatə edir. Bu əsas populyasiyaların metabolik vəziyyətinin yüksək dəqiqlikli portretini təmin etmək üçün bu metodu yüksək ölçülü axın sitometriyası və tək hüceyrəli RNT ardıcıllığı (scRNA-seq) ilə birlikdə istifadə edirik. Bu metod şiş T hüceyrələrində 1-metilnikotinamid (MNA) səviyyəsində əhəmiyyətli dərəcədə artım aşkar etdi və in vitro təcrübələr göstərdi ki, MNA-nın T hüceyrə funksiyasına immunomodulyator təsirinin əvvəllər məlum deyildi. Ümumiyyətlə, bu metod şişlər və immun hüceyrələri arasındakı qarşılıqlı metabolik qarşılıqlı təsirləri aşkar edir və T hüceyrələrinə əsaslanan yumurtalıq xərçəngi immunoterapiyasının müalicəsi üçün faydalı ola biləcək immun tənzimlənməsi metabolitləri haqqında unikal məlumatlar verir. Müalicə imkanları.
Qlükoza qəbulunu eyni vaxtda ölçmək üçün yüksək ölçülü axın sitometriyasından istifadə etdik [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deoksiqlükoza (2-NBDG) və mitoxondrial aktivliyi [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) immun hüceyrələrini və şiş hüceyrə populyasiyalarını fərqləndirən yan-yana tipik markerlərdir (Cədvəl S2 və Şəkil S1A). Bu analiz göstərdi ki, T hüceyrələri ilə müqayisədə assit və şiş hüceyrələri daha yüksək qlükoza qəbul səviyyələrinə malikdir, lakin mitoxondrial aktivlikdə daha kiçik fərqlərə malikdir. Şiş hüceyrələrinin [CD45-EpCAM (EpCAM)+] orta qlükoza qəbulu T hüceyrələrindən üç-dörd dəfə, CD4 + T hüceyrələrinin orta qlükoza qəbulu isə CD8 + T hüceyrələrindən 1,2 dəfə çoxdur ki, bu da şiş infiltrasiya edən limfositlərin (TIL) hətta eyni TME-də fərqli metabolik tələblərə malik olduğunu göstərir (Şəkil 1A). Bunun əksinə olaraq, şiş hüceyrələrindəki mitoxondrial aktivlik CD4 + T hüceyrələrinin aktivliyinə bənzəyir və hər iki hüceyrə növünün mitoxondrial aktivliyi CD8 + T hüceyrələrindən daha yüksəkdir (Şəkil 1B). Ümumiyyətlə, bu nəticələr metabolik səviyyəni göstərir. Şiş hüceyrələrinin metabolik aktivliyi CD4 + T hüceyrələrindən daha yüksəkdir və CD4 + T hüceyrələrinin metabolik aktivliyi CD8 + T hüceyrələrindən daha yüksəkdir. Hüceyrə növləri arasında bu təsirlərə baxmayaraq, CD4 + və CD8 + T hüceyrələrinin metabolik statusunda və ya şişlərlə müqayisədə assitlərdə nisbi nisbətlərində ardıcıl fərq yoxdur (Şəkil 1C). Bunun əksinə olaraq, CD45-hüceyrə fraksiyasında şişdəki EpCAM+ hüceyrələrinin nisbəti assitlərlə müqayisədə artmışdır (Şəkil 1D). Həmçinin EpCAM+ və EpCAM-hüceyrə komponentləri arasında aydın metabolik fərq müşahidə etdik. EpCAM+ (şiş) hüceyrələri EpCAM-hüceyrələrinə nisbətən daha yüksək qlükoza qəbuluna və mitoxondrial aktivliyə malikdir ki, bu da TME-də şiş hüceyrələrindəki fibroblastların metabolik aktivliyindən daha yüksəkdir (Şəkil 1, E və F).
(A və B) Qlükoza qəbulunun (2-NBDG) orta flüoresans intensivliyi (MFI) (A) və CD4 + T hüceyrələrinin mitoxondrial aktivliyi (MitoTracker tünd qırmızı) (B) Təmsiledici qrafiklər (solda) və cədvəlli məlumatlar (Sağda), assit və şişdən alınan CD8 + T hüceyrələri və EpCAM + CD45-şiş hüceyrələri. (C) Assit və şişdə CD4 + və CD8 + hüceyrələrinin (CD3 + T hüceyrələrinin) nisbəti. (D) Assit və şişdə (CD45−) EpCAM + şiş hüceyrələrinin nisbəti. (E və F) EpCAM + CD45-şiş və EpCAM-CD45-matris qlükoza qəbulu (2-NBDG) (E) və mitoxondrial aktivlik (MitoTracker tünd qırmızı) (F) Təmsiledici qrafiklər (solda) və cədvəlli məlumatlar (Sağda) Assitlər və şiş hüceyrələri. (G) Axın sitometriyası ilə CD25, CD137 və PD1 ifadəsinin təmsiledici qrafikləri. (H və I) CD4 + T hüceyrələrində (H) və CD8 + T hüceyrələrində (I) CD25, CD137 və PD1 ifadəsi. (J və K) CCR7 və CD45RO ifadəsinə əsaslanan sadəlövh, mərkəzi yaddaş (Tcm), effektor (Teff) və effektor yaddaş (Tem) fenotipləri. Assit və şişlərdə CD4 + T hüceyrələrinin (J) və CD8 + T hüceyrələrinin (K) təmsilçi şəkilləri (solda) və cədvəl məlumatları (sağda). P dəyərləri cütləşdirilmiş t-testi ilə müəyyən edilir (*P<0.05, **P<0.01 və ***P<0.001). Xətt uyğun xəstələri təmsil edir (n = 6). FMO, flüoresans mənfi bir; MFI, median flüoresans intensivliyi.
Əlavə təhlillər yüksək dərəcədə həll olunmuş T hüceyrə fenotipik statusu arasında digər əhəmiyyətli fərqləri aşkar etdi. Şişlərdə aktivləşdirilmiş (Şəkil 1, G-dən I-yə qədər) və effektor yaddaşı (Şəkil 1, J və K) assitlərdən (CD3 + T hüceyrələrinin nisbəti) daha çox rast gəlinir. Eynilə, aktivasiya markerlərinin (CD25 və CD137) və tükənmə markerlərinin [proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümü zülalı 1 (PD1)] ifadəsi ilə fenotipin təhlili göstərdi ki, bu populyasiyaların metabolik xüsusiyyətləri fərqli olsa da (Şəkil S1, B-dən E-yə qədər), lakin sadəlövh, effektor və ya yaddaş alt dəstləri arasında ardıcıl olaraq heç bir əhəmiyyətli metabolik fərq müşahidə edilməyib (Şəkil S1, F-dən I-yə qədər). Bu nəticələr avtomatik olaraq hüceyrə fenotiplərini təyin etmək üçün maşın öyrənmə metodlarından istifadə etməklə təsdiqləndi (21), bu da xəstənin assitlərində çox sayda sümük iliyi hüceyrəsinin (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) mövcudluğunu daha da aşkar etdi (Şəkil S2A). Müəyyən edilmiş bütün hüceyrə növləri arasında bu miyeloid hüceyrə populyasiyasında ən yüksək qlükoza udulması və mitoxondrial aktivlik müşahidə olunmuşdur (Şəkil S2, B-dən G-yə). Bu nəticələr HGSC xəstələrində assit və şişlərdə aşkar edilən çoxsaylı hüceyrə növləri arasında güclü metabolik fərqləri vurğulayır.
TIL-in metabonomik xüsusiyyətlərini anlamaqda əsas çətinlik şişlərdən kifayət qədər təmizlik, keyfiyyət və kəmiyyətə malik T hüceyrə nümunələrini təcrid etmək zərurətidir. Son tədqiqatlar göstərir ki, axın sitometriyasına əsaslanan çeşidləmə və muncuq zənginləşdirmə metodları hüceyrə metabolit profillərində dəyişikliklərə səbəb ola bilər (22-24). Bu problemi aradan qaldırmaq üçün LC-MS/MS ilə analizdən əvvəl cərrahi yolla rezeksiya edilmiş insan yumurtalıq xərçəngindən TIL-i təcrid etmək və təcrid etmək üçün muncuq zənginləşdirmə metodunu optimallaşdırdıq (bax: Materiallar və Metodlar; Şəkil 2A). Bu protokolun metabolit dəyişikliklərinə ümumi təsirini qiymətləndirmək üçün yuxarıdakı muncuq ayrılma mərhələsindən sonra sağlam donorlar tərəfindən aktivləşdirilmiş T hüceyrələrinin metabolit profillərini muncuq ayrılmamış, lakin buz üzərində qalan hüceyrələrlə müqayisə etdik. Bu keyfiyyətə nəzarət təhlili bu iki şərt arasında yüksək korrelyasiya olduğunu (r = 0.77) və 86 metabolit qrupunun texniki təkrarlanma qabiliyyətinin yüksək təkrarlanma qabiliyyətinə malik olduğunu aşkar etdi (Şəkil 2B). Buna görə də, bu üsullar hüceyrə tipi zənginləşdirməsindən keçən hüceyrələrdə dəqiq metabolit analizi apara bilər və beləliklə, HGSC-də spesifik metabolitləri müəyyən etmək üçün ilk yüksək qətnaməli platforma təmin edir və bununla da insanların hüceyrə spesifikliyini daha dərindən anlamalarına imkan verir. Cinsi metabolizm proqramı.
(A) Maqnit muncuq zənginləşdirilməsinin sxematik diaqramı. LC-MS/MS ilə analizdən əvvəl hüceyrələr ardıcıl üç maqnit muncuq zənginləşdirilməsi mərhələsindən keçəcək və ya buz üzərində qalacaq. (B) Zənginləşdirmə növünün metabolitlərin bolluğuna təsiri. Hər zənginləşdirmə növü üçün üç ölçmənin ortalaması ± SE. Boz xətt 1:1 nisbətini təmsil edir. Ox etiketində göstərilən təkrarlanan ölçmələrin sinifdaxili korrelyasiyası (ICC). NAD, nikotinamid adenin dinukleotid. (C) Xəstə metabolit analizinin iş axınının sxematik diaqramı. Assitlər və ya şişlər xəstələrdən toplanır və dondurulur. Hər nümunənin kiçik bir hissəsi axın sitometriyası ilə təhlil edildi, qalan nümunələr isə CD4+, CD8+ və CD45- hüceyrələri üçün üç zənginləşdirmə mərhələsindən keçdi. Bu hüceyrə fraksiyaları LC-MS/MS istifadə edərək təhlil edildi. (D) Standartlaşdırılmış metabolit bolluğunun istilik xəritəsi. Dendrogram, nümunələr arasındakı Evklid məsafələrinin Ward klasterləşməsini təmsil edir. (E) Nümunə metabolit xəritəsinin əsas komponent təhlili (PCA), hər nümunənin üç təkrarını göstərir, eyni xəstədən nümunələr bir xətt ilə birləşdirilir. (F) Nümunənin metabolit profilinin PCA-sı xəstəyə şərtləndirilir (yəni, qismən artıqlıqdan istifadə etməklə); nümunə növü qabarıq gövdə ilə məhdudlaşır. PC1, əsas komponent 1; PC2, əsas komponent 2.
Daha sonra, bu zənginləşdirmə metodunu altı HGSC xəstəsinin ilkin assit və şişlərindəki CD4+, CD8+ və CD45-hüceyrə fraksiyalarındakı 99 metabolitləri təhlil etmək üçün tətbiq etdik (Şəkil 2C, Şəkil S3A və Cədvəl S3 və S4). Maraq populyasiyasının sayı orijinal böyük canlı hüceyrə nümunəsinin 2%-dən 70%-ə qədərini təşkil edir və hüceyrələrin nisbəti xəstələr arasında çox dəyişir. Muncuqları ayırdıqdan sonra, zənginləşdirilmiş maraq fraksiyası (CD4+, CD8+ və ya CD45-) nümunədəki bütün canlı hüceyrələrin orta hesabla 85%-dən çoxunu təşkil edir. Bu zənginləşdirmə metodu bizə insan şiş toxuması metabolizmasından hüceyrə populyasiyalarını təhlil etməyə imkan verir ki, bunu böyük nümunələrdən etmək mümkün deyil. Bu protokoldan istifadə edərək, bu iki yaxşı xarakterizə olunan immunosupressiv metabolit olan l-kinurenin və adenozinin şiş T hüceyrələrində və ya şiş hüceyrələrində yüksəldiyini müəyyən etdik (Şəkil S3, B və C). Buna görə də, bu nəticələr hüceyrə ayırma və kütlə spektrometriyası texnologiyamızın xəstə toxumalarında bioloji cəhətdən əhəmiyyətli metabolitləri tapmaq üçün sədaqətini və qabiliyyətini nümayiş etdirir.
Təhlillərimiz həmçinin xəstələr daxilində və arasında hüceyrə növlərinin güclü metabolik ayrılmasını aşkar etdi (Şəkil 2D və Şəkil S4A). Xüsusilə, digər xəstələrlə müqayisədə 70-ci xəstə fərqli metabolik xüsusiyyətlər göstərdi (Şəkil 2E və Şəkil S4B), bu da xəstələr arasında əhəmiyyətli metabolik heterojenliyin ola biləcəyini göstərir. Qeyd etmək lazımdır ki, digər xəstələrlə müqayisədə (1,2-2 litr; Cədvəl S1), 70-ci xəstədə toplanan assitlərin ümumi miqdarı (80 ml) daha az idi. Əsas komponent təhlili zamanı (məsələn, qismən artıqlıq təhlili istifadə edilərək) xəstələrarası heterojenliyin nəzarəti hüceyrə növləri arasında ardıcıl dəyişiklikləri göstərir və hüceyrə növləri və/və ya mikro mühit metabolit profilinə görə aydın şəkildə birləşdirilir (Şəkil 2F). Tək metabolitlərin təhlili bu təsirləri vurğuladı və hüceyrə növləri ilə mikro mühit arasında əhəmiyyətli fərqlər aşkar etdi. Qeyd etmək lazımdır ki, müşahidə edilən ən ifrat fərq adətən CD45-hüceyrələrində və şişə infiltrasiya edən CD4+ və CD8+ hüceyrələrində zənginləşən MNA-dır (Şəkil 3A). CD4+ hüceyrələri üçün bu təsir ən çox nəzərə çarpır və CD8+ hüceyrələrindəki MNA da ətraf mühitdən güclü təsirlənir. Lakin bu, vacib deyil, çünki altı xəstədən yalnız üçünün şiş CD8+ balları qiymətləndirilə bilər. MNA-ya əlavə olaraq, assit və şişlərdəki müxtəlif növ hüceyrələrdə TIL-də zəif xarakterizə olunan digər metabolitlər də fərqli dərəcədə zəngindir (Şəkillər S3 və S4). Buna görə də, bu məlumatlar sonrakı tədqiqatlar üçün perspektivli bir immunomodulyator metabolitlər dəstini ortaya qoyur.
(A) Assit və şişdən CD4+, CD8+ və CD45-hüceyrələrində MNA-nın normallaşdırılmış tərkibi. Qutu qrafiki median (xətt), kvartillərarası diapazon (çərçivə menteşesi) və məlumat diapazonunu kvartillərarası diapazonun (çərçivə bığ) 1,5 qatına qədər göstərir. Xəstə Materialları və Metodları bölməsində təsvir edildiyi kimi, P dəyərini təyin etmək üçün xəstənin limma dəyərindən istifadə edin (*P<0,05 və **P<0,01). (B) MNA metabolizmasının sxematik diaqramı (60). Metabolitlər: S-adenozil-1-metionin; SAH, S-adenozin-1-homosistein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid riboza; NMN, nikotinamid mononukleotid. Fermentlər (yaşıl): NNMT, nikotinamid N-metiltransferaza; SIRT, sirtuinlər; NAMPT, nikotinamid fosforibozil transferaza; AOX1, aldehid oksidaza 1; NRK, nikotinamid ribosid kinaza; NMNAT, nikotinamid mononukleotid adenilat transferaza; Pnp1, purin nukleozid fosforilaza. (C) Assitlərin (boz) və şişin scRNA-sekvensiyasının t-SNE-si (qırmızı; n = 3 xəstə). (D) scRNA-sekvensiyası istifadə edilərək müəyyən edilmiş müxtəlif hüceyrə populyasiyalarında NNMT ifadəsi. (E) SK-OV-3, insan embrion böyrəyi (HEK) 293T, T hüceyrələri və MNA ilə müalicə olunmuş T hüceyrələrində NNMT və AOX1 ifadəsi. Qatlanmış ifadə SK-OV-3-ə nisbətən göstərilir. SEM ilə ifadə nümunəsi göstərilir (n = 6 sağlam donor). 35-dən çox Ct dəyərləri aşkarlanmayan hesab olunur (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, T hüceyrələrində və 8mM MNA ilə müalicə olunmuş T hüceyrələrində SLC22A1 və SLC22A2 ifadəsi. Qatlanmış ifadə SK-OV-3-ə nisbətən göstərilir. SEM ilə ifadə nümunəsi göstərilir (n = 6 sağlam donor). 35-dən çox Ct dəyərləri aşkarlanmayan hesab olunur (UD). (G) MNA ilə 72 saatlıq inkubasiyadan sonra aktivləşdirilmiş sağlam donor T hüceyrələrində hüceyrə MNA tərkibi. SEM ilə ifadə nümunəsi göstərilir (n = 4 sağlam donor).
MNA, nikotinamid N-metiltransferaza (NNMT; Şəkil 3B) vasitəsilə S-adenozil-1-metionindən (SAM) metil qrupunun nikotinamid N-metiltransferaza (NNMT; Şəkil 3B) tərəfindən nikotinamidə (NA) köçürülməsi ilə istehsal olunur. NNMT müxtəlif insan xərçənglərində həddindən artıq ifadə olunur və proliferasiya, invaziya və metastazla əlaqələndirilir (25-27). TME-də T hüceyrələrində MNA mənbəyini daha yaxşı başa düşmək üçün üç HGSC xəstəsinin assit və şişlərində hüceyrə növləri üzrə NNMT ifadəsini xarakterizə etmək üçün scRNA-seq istifadə etdik (Cədvəl S5). Təxminən 6500 hüceyrənin təhlili göstərdi ki, assit və şiş mühitində NNMT ifadəsi ehtimal olunan fibroblast və şiş hüceyrə populyasiyaları ilə məhdudlaşmışdır (Şəkil 3, C və D). Qeyd etmək lazımdır ki, PTPRC (CD45 +) ifadə edən heç bir populyasiyada aşkar NNMT ifadəsi yoxdur (Şəkil 3D və Şəkil S5A), bu da metabolit spektrində aşkarlanan MNA-nın T hüceyrələrinə daxil edildiyini göstərir. Aldehid oksidaza 1-in (AOX1) ifadəsi MNA-nı 1-metil-2-piridon-5-karboksamidə (2-PYR) və ya 1-metil-4-piridon-5-karboksamidə (4-PYR) çevirir; Şəkil 3B) həmçinin COL1A1 ifadə edən fibroblastların populyasiyaları ilə məhdudlaşır (Şəkil S5A), bunlar birlikdə T hüceyrələrinin ənənəvi MNA metabolizması qabiliyyətinə malik olmadığını göstərir. Bu MNA ilə əlaqəli genlərin ifadə modeli HGSC xəstələrindən alınan assitlərdən əldə edilən ikinci müstəqil hüceyrə məlumatları dəsti ilə təsdiqlənmişdir (Şəkil S5B; n = 6) (16). Bundan əlavə, MNA ilə müalicə olunan sağlam donor T hüceyrələrinin kəmiyyət polimeraza zəncirvari reaksiyası (qPCR) təhlili göstərdi ki, nəzarət SK-OV-3 yumurtalıq şişi hüceyrələri ilə müqayisədə NNMT və ya AOX1 demək olar ki, ifadə olunmayıb (Şəkil 3E). Bu gözlənilməz nəticələr MNA-nın fibroblastlardan və ya şişlərdən TME-də bitişik T hüceyrələrinə ifraz oluna biləcəyini göstərir.
Namizədlər arasında həll olan daşıyıcı 22 (SLC22) ailəsi (SLC22A1, SLC22A2 və SLC22A3) tərəfindən kodlanan 1-dən 3-ə qədər üzvi kation daşıyıcıları ailəsi (OCT1, OCT2 və OCT3) olsa da, MNA-nın potensial daşıyıcıları hələ də müəyyən edilməmişdir (28). Sağlam donor T hüceyrələrindən alınan mRNA-nın QPCR-i SLC22A1-in aşağı ifadə səviyyələrini, lakin SLC22A2-nin aşkar edilə bilməyən səviyyələrini göstərdi ki, bu da onun əvvəllər ədəbiyyatda bildirildiyini təsdiqlədi (Şəkil 3F) (29). Əksinə, SK-OV-3 yumurtalıq şiş hüceyrə xətti hər iki daşıyıcının yüksək səviyyələrini ifadə etdi (Şəkil 3F).
T hüceyrələrinin xarici MNA-nı udmaq qabiliyyətinə malik olma ehtimalını yoxlamaq üçün sağlam donor T hüceyrələri müxtəlif MNA konsentrasiyalarının iştirakı ilə 72 saat ərzində becərildi. Ekzogen MNA olmadığı təqdirdə, MNA-nın hüceyrə tərkibi aşkar edilə bilməz (Şəkil 3G). Lakin, ekzogen MNA ilə müalicə olunan aktivləşdirilmiş T hüceyrələri hüceyrələrdə MNA tərkibində dozadan asılı olaraq 6 mM MNA-ya qədər artım göstərdi (Şəkil 3G). Bu nəticə göstərir ki, daşıyıcı ifadəsinin aşağı səviyyəsinə və hüceyrədaxili MNA metabolizmasından məsul olan əsas fermentin olmamasına baxmayaraq, TIL hələ də MNA-nı udmaq qabiliyyətinə malikdir.
Xəstələrin T hüceyrələrindəki metabolitlərin spektri və in vitro MNA udma təcrübələri xərçənglə əlaqəli fibroblastların (CAF) MNA ifraz etməsi və şiş hüceyrələrinin TIL-in fenotipini və funksiyasını tənzimləyə bilmə ehtimalını artırır. MNA-nın T hüceyrələrinə təsirini müəyyən etmək üçün sağlam donor T hüceyrələri MNA-nın iştirakı və ya olmaması halında in vitro aktivləşdirildi və onların proliferasiyası və sitokin istehsalı qiymətləndirildi. Ən yüksək dozada MNA əlavə edildikdən 7 gün sonra populyasiyanın ikiqat sayı orta dərəcədə azaldı, bütün dozalarda isə canlılıq qorunub saxlanıldı (Şəkil 4A). Bundan əlavə, ekzogen MNA-nın müalicəsi şiş nekroz faktoru-α ifadə edən CD4+ və CD8+ T hüceyrələrinin nisbətində artımla nəticələndi (TNFα; Şəkil 4B). Bunun əksinə olaraq, IFN-γ-nin hüceyrədaxili istehsalı CD4+ T hüceyrələrində əhəmiyyətli dərəcədə azaldı, lakin CD8+ T hüceyrələrində azalmadı və interlökin 2-də (IL-2; Şəkil 4, C və D) heç bir əhəmiyyətli dəyişiklik olmadı. Buna görə də, bu MNA ilə müalicə olunmuş T hüceyrə kulturalarından alınan supernatantların fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (ELISA) TNFα-da əhəmiyyətli dərəcədə artım, IFN-γ-da azalma və IL-2-də heç bir dəyişiklik göstərmədi (Şəkil 4, E-dən G-yə). . IFN-γ-nin azalması, MNA-nın T hüceyrələrinin şiş əleyhinə aktivliyinin inhibə edilməsində rol oynaya biləcəyini göstərir. MNA-nın T hüceyrə vasitəçiliyi ilə sitotoksikliyə təsirini simulyasiya etmək üçün, yaşıl flüoresan protein (GFP) -CAR-T) hüceyrələri ilə tənzimlənən folat reseptoru α və CAR-T (GFP) hədəf alan ximerik antigen reseptoru T (FRα-CAR-T) hüceyrələri sağlam donor periferik qan mononükleer hüceyrələri (PBMC) tərəfindən istehsal olunur. CAR-T hüceyrələri MNA-nın iştirakı ilə 24 saat ərzində becərildi və sonra 10:1 effektor-hədəf nisbətində folat reseptoru α ifadə edən insan SK-OV-3 yumurtalıq şiş hüceyrələri ilə birgə becərildi. MNA müalicəsi FRα-CAR-T hüceyrələrinin öldürücü aktivliyində əhəmiyyətli dərəcədə azalma ilə nəticələndi ki, bu da adenozinlə müalicə edilən FRα-CAR-T hüceyrələrinə bənzəyirdi (Şəkil 4H).
(A) 7-ci gündə birbaşa kulturadan alınan ümumi canlı hüceyrə sayı və populyasiyanın ikiqat artması (PD). Sütun qrafiki altı sağlam donorun ortalaması + SEM-ni təmsil edir. Ən azı n = 3 müstəqil təcrübədən əldə edilən məlumatları təmsil edir. (B-dən D-yə) CD3/CD28 və IL-2 7 gün ərzində müvafiq MNA konsentrasiyalarında T hüceyrələrini aktivləşdirmək üçün istifadə edilmişdir. Təhlildən əvvəl hüceyrələr 4 saat ərzində GolgiStop ilə PMA/ionomisin ilə stimullaşdırıldı. T hüceyrələrində TNFα (B) ifadəsi. Canlı hüceyrələrdə TNFα ifadəsinin nümunə şəkli (solda) və cədvəl məlumatları (sağda). T hüceyrələrində IFN-γ (C) və IL-2 (D) ifadəsi. Sitokinlərin ifadəsi axın sitometriyası ilə ölçüldü. Sütun qrafiki ortalaması (n = 6 sağlam donor) + SEM-i təmsil edir. P dəyərini təyin etmək üçün birtərəfli dispersiya təhlili və təkrarlanan ölçmələrdən (*P<0.05 və **P<0.01) istifadə edin. Ən azı n = 3 müstəqil təcrübədən əldə edilən məlumatları təmsil edir. (E-dən G-yə) CD3/CD28 və IL-2, T hüceyrələrini müvafiq MNA konsentrasiyalarında 7 gün ərzində aktivləşdirmək üçün istifadə edilmişdir. Ortam PMA/ionomisin stimullaşdırılmasından 4 saat əvvəl və sonra toplanmışdır. TNFα (E), IFN-γ (F) və IL-2 (G) konsentrasiyaları ELISA ilə ölçülmüşdür. Sütun qrafiki ortalamanı (n = 5 sağlam donor) + SEM-i təmsil edir. P dəyəri birtərəfli dispersiya təhlili və təkrar ölçmələr (*P<0.05) istifadə edilərək müəyyən edilmişdir. Nöqtəli xətt aşkarlamanın aşkarlama limitini göstərir. (H) Hüceyrə lizisi analizi. FRα-CAR-T və ya GFP-CAR-T hüceyrələri 24 saat ərzində adenozin (250μM) və ya MNA (10 mM) ilə tənzimlənmiş və ya müalicə edilməmiş (Ctrl) qoyulmuşdur. SK-OV-3 hüceyrələrinin öldürülmə faizi ölçülmüşdür. P dəyəri Welch t testi ilə müəyyən edilmişdir (*P<0.5 və **P<0.01).
MNA-dan asılı TNFα ifadə tənzimlənməsinin mexaniki bir anlayışını əldə etmək üçün MNA ilə müalicə olunmuş T hüceyrələrinin TNFα mRNT-sindəki dəyişikliklər qiymətləndirilmişdir (Şəkil 5A). MNA ilə müalicə olunmuş sağlam donor T hüceyrələri TNFα transkripsiya səviyyələrində ikiqat artım göstərmişdir ki, bu da MNA-nın TNFα transkripsiya tənzimlənməsindən asılı olduğunu göstərir. Bu mümkün tənzimləmə mexanizmini araşdırmaq üçün TNFα-nı tənzimləyən iki məlum transkripsiya amili, yəni aktivləşdirilmiş T hüceyrə nüvə faktoru (NFAT) və spesifik protein 1 (Sp1), proksimal TNFα promotoruna MNA bağlanmasına cavab olaraq qiymətləndirilmişdir (30). TNFα promotoru, bir yerdə üst-üstə düşən 6 müəyyən edilmiş NFAT bağlanma yeri və 2 Sp1 bağlanma yeri ehtiva edir [5'qapaqdan -55 əsas cütü (bp)] (30). Xromatin immunpresipitasiyası (ChIP) göstərdi ki, MNA ilə müalicə edildikdə Sp1-in TNFα promotoruna bağlanması üçqat artmışdır. NFAT-ın daxil edilməsi də artmış və əhəmiyyətinə yaxınlaşmışdır (Şəkil 5B). Bu məlumatlar göstərir ki, MNA Sp1 transkripsiyası vasitəsilə TNFα ifadəsini və daha az dərəcədə NFAT ifadəsini tənzimləyir.
(A) MNA olmadan becərilən T hüceyrələri ilə müqayisədə, MNA ilə müalicə olunmuş T hüceyrələrində TNFα ifadəsinin qat dəyişikliyi. SEM ilə ifadə nümunəsi göstərilir (n = 5 sağlam donor). Ən azı n = 3 müstəqil təcrübədən alınan məlumatları təmsil edir. (B) NFAT və Sp1-dən sonra 8 mM MNA ilə və ya onsuz müalicə olunmuş T hüceyrələrinin TNFα promotoru (Ctrl) və PMA/ionomisin stimulyasiyası ilə 4 saat ərzində birləşdirildi. İmmunoqlobulin G (IgG) və H3 müvafiq olaraq immunpresipitasiya üçün mənfi və müsbət nəzarət qrupları kimi istifadə edildi. ChIP-in kəmiyyətləndirilməsi göstərdi ki, MNA ilə müalicə olunmuş hüceyrələrdə Sp1 və NFAT-ın TNFα promotoruna bağlanması nəzarət qrupu ilə müqayisədə bir neçə dəfə artmışdır. Ən azı n = 3 müstəqil təcrübədən alınan məlumatları təmsil edir. Çoxsaylı t-testlərlə müəyyən edilmiş P dəyəri (*** P <0.01). (C) HGSC assitləri ilə müqayisədə T hüceyrələri (sitotoksik olmayan) şişdə TNF-nin artan ifadəsini göstərdi. Rənglər fərqli xəstələri təmsil edir. Göstərilən hüceyrələr təsadüfi olaraq 300-ə qədər nümunə götürülmüş və həddindən artıq çəkilməni məhdudlaşdırmaq üçün titrəmişdir (** Padj = 0.0076). (D) Yumurtalıq xərçəngi üçün təklif olunan MNA modeli. MNA şiş hüceyrələrində və fibroblastlarda TME-də istehsal olunur və T hüceyrələri tərəfindən mənimsənilir. MNA Sp1-in TNFα promotoruna bağlanmasını artırır və bu da TNFα transkripsiyasının və TNFα sitokin istehsalının artmasına səbəb olur. MNA həmçinin IFN-γ-nin azalmasına səbəb olur. T hüceyrə funksiyasının inhibə edilməsi öldürmə qabiliyyətinin azalmasına və şiş böyüməsinin sürətlənməsinə səbəb olur.
Məlumatlara görə, TNFα ön və arxadan asılı şiş əleyhinə və şiş əleyhinə təsirlərə malikdir, lakin yumurtalıq xərçənginin böyüməsini və metastazını təşviq etməkdə tanınmış rola malikdir (31-33). Məlumatlara görə, yumurtalıq xərçəngi olan xəstələrdə assit və şiş toxumalarında TNFα konsentrasiyası xoşxassəli toxumalara nisbətən daha yüksəkdir (34-36). Mexanizm baxımından TNFα ağ qan hüceyrələrinin aktivləşməsini, funksiyasını və proliferasiyasını tənzimləyə və xərçəng hüceyrələrinin fenotipini dəyişdirə bilər (37, 38). Bu tapıntılara uyğun olaraq, diferensial gen ifadəsi təhlili göstərdi ki, TNF şiş toxumalarındakı T hüceyrələrində assitlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artırılıb (Şəkil 5C). TNF ifadəsindəki artım yalnız sitotoksik olmayan fenotipə malik T hüceyrə populyasiyalarında özünü göstərib (Şəkil S5A). Xülasə, bu məlumatlar MNA-nın HGSC-də ikili immunosupressiv və şiş təşviqedici təsirlərə malik olduğu fikrini dəstəkləyir.
Axın sitometriyasına əsaslanan flüoresan etiketləmə TIL metabolizmasını öyrənmək üçün əsas metod halına gəlmişdir. Bu tədqiqatlar göstərmişdir ki, periferik qan limfositləri və ya ikincili limfoid orqanların T hüceyrələri ilə müqayisədə siçan və insan TIL-ləri qlükoza udmağa daha çox meyllidir (4, 39) və mitoxondrial funksiyanın tədricən itirilməsinə (19, 40). Bu tədqiqatda oxşar nəticələr müşahidə etsək də, əsas inkişaf şiş hüceyrələrinin metabolizmasını və eyni rezeksiya edilmiş şiş toxumasından TIL-i müqayisə etməkdir. Əvvəlki hesabatların bəzilərinə uyğun olaraq, assit və şişlərdən olan şiş (CD45-EpCAM +) hüceyrələri CD8 + və CD4 + T hüceyrələrinə nisbətən daha yüksək qlükoza udmasına malikdir və bu da şiş hüceyrələrinin yüksək qlükoza udmasının T hüceyrələri ilə müqayisə edilə biləcəyini dəstəkləyir. T hüceyrə rəqabəti konsepsiyası. TME. Lakin, şiş hüceyrələrinin mitoxondrial aktivliyi CD8 + T hüceyrələrindən daha yüksəkdir, lakin mitoxondrial aktivlik CD4 + T hüceyrələrinin aktivliyinə bənzəyir. Bu nəticələr oksidləşdirici metabolizmin şiş hüceyrələri üçün vacib olduğu mövzusunu gücləndirir (41, 42). Onlar həmçinin CD8 + T hüceyrələrinin CD4 + T hüceyrələrinə nisbətən oksidləşdirici disfunksiyaya daha çox həssas ola biləcəyini və ya CD4 + T hüceyrələrinin mitoxondrial aktivliyi qorumaq üçün qlükoza xaricində karbon mənbələrindən istifadə edə biləcəyini irəli sürürlər (43, 44). Qeyd etmək lazımdır ki, assitlərdə CD4 + T effektorları, T effektor yaddaşı və T mərkəzi yaddaş hüceyrələri arasında qlükoza udulmasında və ya mitoxondrial aktivlikdə heç bir fərq müşahidə etmədik. Eynilə, şişlərdə CD8 + T hüceyrələrinin differensiasiya vəziyyətinin qlükoza udulmasında dəyişikliklərlə heç bir əlaqəsi yoxdur və bu da in vitro becərilən T hüceyrələri ilə in vivo insan TIL arasındakı əhəmiyyətli fərqi vurğulayır (22). Bu müşahidələr həmçinin qərəzsiz avtomatik hüceyrə populyasiyasının bölüşdürülməsi ilə təsdiqləndi və bu da şiş hüceyrələrindən daha yüksək qlükoza udulmasına və mitoxondrial aktivliyə malik CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + hüceyrələrinin üstünlük təşkil etdiyini, lakin metabolik aktiv hüceyrə populyasiyasına malik olduğunu göstərdi. Bu populyasiya scRNA-seq analizində müəyyən edilmiş miyeloid supressor hüceyrələrinin və ya plazmasitoid dendritik hüceyrələrin ehtimal olunan alt populyasiyasını təmsil edə bilər. Bunların hər ikisi insan yumurtalıq şişlərində qeydə alınsa da [45], hələ də bu miyeloid alt populyasiyasını təsvir etmək üçün əlavə iş tələb olunur.
Axın sitometriyasına əsaslanan metodlar hüceyrə növləri arasında qlükoza və oksidləşdirici metabolizmadakı ümumi fərqləri aydınlaşdıra bilsə də, TME-də mitoxondrial metabolizma üçün qlükoza və ya digər karbon mənbələri tərəfindən istehsal olunan dəqiq metabolitlər hələ müəyyən edilməyib. Metabolik maddələrin mövcudluğunu və ya olmamasını müəyyən bir TIL alt qrupuna təyin etmək, hüceyrə populyasiyasının çıxarılan toxumadan təmizlənməsini tələb edir. Buna görə də, hüceyrə zənginləşdirmə metodumuz kütlə spektrometriyası ilə birləşdirildikdə, uyğun xəstə nümunələrində T hüceyrələrində və şiş hüceyrə populyasiyalarında fərqli şəkildə zənginləşdirilmiş metabolitlər haqqında məlumat verə bilər. Bu metodun flüoresansla aktivləşdirilmiş hüceyrə çeşidlənməsinə nisbətən üstünlükləri olsa da, müəyyən metabolit kitabxanaları daxili sabitlik və/və ya sürətli dövriyyə sürəti səbəbindən təsirlənə bilər (22). Buna baxmayaraq, metodumuz nümunə növləri arasında çox fərqli olduqları üçün iki tanınmış immunosupressiv metabolit, adenozin və kinurenini müəyyən edə bildi.
Şişlərin və TIL alt tiplərinin metabonomik təhlili yumurtalıq TME-də metabolitlərin rolu haqqında daha çox məlumat verir. Birincisi, axın sitometriyasından istifadə edərək, şişlər və CD4 + T hüceyrələri arasında mitoxondrial aktivlikdə heç bir fərq olmadığını müəyyən etdik. Lakin, LC-MS/MS təhlili bu populyasiyalar arasında metabolitlərin bolluğunda əhəmiyyətli dəyişikliklər aşkar etdi ki, bu da TIL metabolizması və onun ümumi metabolik aktivliyi haqqında nəticələrin diqqətlə şərh edilməsini tələb etdiyini göstərir. İkincisi, MNA, şişlərdə deyil, assitlərdə CD45-hüceyrələri və T hüceyrələri arasında ən böyük fərqə malik metabolitdir. Buna görə də, bölmələşmə və şişin yeri TIL metabolizmasına fərqli təsir göstərə bilər ki, bu da müəyyən bir mikro mühitdə mümkün heterojenliyi vurğulayır. Üçüncüsü, MNA istehsal edən NNMT fermentinin ifadəsi əsasən CAF ilə məhdudlaşır ki, bu da daha az dərəcədə şiş hüceyrələridir, lakin şişdən əldə edilən T hüceyrələrində aşkar edilə bilən MNA səviyyələri müşahidə olunur. Yumurtalıq CAF-da NNMT-nin həddindən artıq ifadəsi, qismən CAF metabolizmasının, şiş invaziyasının və metastazının təşviqi ilə əlaqədar olaraq məlum xərçəng təşviqedici təsirə malikdir (27). Ümumi TIL səviyyəsi orta səviyyədə olsa da, CAF-da NNMT-nin ifadəsi zəif proqnozla əlaqəli olan Xərçəng Genomu Atlasının (TCGA) mezenximal alt növü ilə sıx bağlıdır (27, 46, 47). Nəhayət, MNA-nın parçalanmasından məsul olan AOX1 fermentinin ifadəsi də CAF populyasiyasında məhduddur ki, bu da T hüceyrələrinin MNA-nı metabolizə etmək qabiliyyətinin olmadığını göstərir. Bu nəticələr, bu tapıntını təsdiqləmək üçün əlavə işlərin aparılmasına ehtiyac olsa da, T hüceyrələrində yüksək səviyyəli MNA-nın immunosupressiv CAF mikromühitinin mövcudluğunu göstərə biləcəyi fikrini dəstəkləyir.
MNA daşıyıcılarının aşağı ifadə səviyyəsi və MNA metabolizmasında iştirak edən əsas zülalların aşkarlanmayan səviyyələri nəzərə alınmaqla, T hüceyrələrində MNA-nın olması gözlənilməzdir. Nə NNMT, nə də AOX1 iki müstəqil kohortun scRNA-seq analizi və hədəflənmiş qPCR ilə aşkar edilə bilmədi. Bu nəticələr göstərir ki, MNA T hüceyrələri tərəfindən sintez olunmur, əksinə ətrafdakı TME-dən sorulur. In vitro təcrübələr göstərir ki, T hüceyrələri ekzogen MNA toplamağa meyllidir.
İn vitro tədqiqatlarımız göstərdi ki, ekzogen MNA T hüceyrələrində TNFα ifadəsini induksiya edir və Sp1-in TNFα promotoruna bağlanmasını artırır. TNFα həm şiş əleyhinə, həm də şiş əleyhinə funksiyalara malik olsa da, yumurtalıq xərçəngində TNFα yumurtalıq xərçənginin böyüməsini təşviq edə bilər (31-33). Yumurtalıq şişi hüceyrə kulturasında TNFα-nın neytrallaşdırılması və ya siçan modellərində TNFα siqnalının aradan qaldırılması TNFα vasitəçiliyi ilə iltihab sitokinlərinin istehsalını yaxşılaşdıra və şişin böyüməsini maneə törədə bilər (32, 35). Buna görə də, bu halda, TME-dən əldə edilən MNA, autokrin döngəsi vasitəsilə TNFα-dan asılı mexanizm vasitəsilə iltihabəleyhinə metabolit kimi çıxış edə bilər və bununla da yumurtalıq xərçənginin yaranmasını və yayılmasını təşviq edir (31). Bu ehtimala əsaslanaraq, TNFα blokadası yumurtalıq xərçəngi üçün potensial terapevtik vasitə kimi öyrənilir (37, 48, 49). Bundan əlavə, MNA CAR-T hüceyrələrinin yumurtalıq şişi hüceyrələrinə sitotoksikliyini pozur və MNA vasitəçiliyi ilə immun supressiyası üçün əlavə dəlil təqdim edir. Ümumilikdə, bu nəticələr şişlərin və CAF hüceyrələrinin MNA-nın hüceyrədənkənar TME-yə ifraz etdiyi bir model təklif edir. (i) TNF-in yaratdığı yumurtalıq xərçəngi böyüməsinin stimullaşdırılması və (ii) MNA-nın yaratdığı T hüceyrə sitotoksik aktivliyinin inhibə edilməsi yolu ilə bu, ikiqat şiş təsirinə malik ola bilər (Şəkil 5D).
Nəticə olaraq, sürətli hüceyrə zənginləşdirilməsi, tək hüceyrə ardıcıllığı və metabolik profilləmənin kombinasiyasını tətbiq etməklə, bu tədqiqat HGSC xəstələrində şişlər və assit hüceyrələri arasında böyük immunometabolik fərqləri aşkar etdi. Bu hərtərəfli təhlil T hüceyrələri arasında qlükoza qəbulu və mitoxondrial aktivlikdə fərqlərin olduğunu göstərdi və MNA-nı hüceyrədənkənar muxtar immun tənzimləyici metabolit kimi müəyyən etdi. Bu məlumatlar TME-nin insan xərçənglərində T hüceyrə metabolizmasına necə təsir etdiyinə təsir göstərir. T hüceyrələri və xərçəng hüceyrələri arasında qida maddələri üçün birbaşa rəqabət bildirilsə də, metabolitlər şişin irəliləməsini təşviq etmək və ehtimal ki, endogen immun reaksiyalarını yatırmaq üçün dolayı tənzimləyicilər kimi də çıxış edə bilər. Bu tənzimləyici metabolitlərin funksional rolunun daha ətraflı təsviri şiş əleyhinə immun reaksiyasını gücləndirmək üçün alternativ strategiyalar aça bilər.
Xəstə nümunələri və klinik məlumatlar Kanada Toxuma Anbarı Şəbəkəsi tərəfindən sertifikatlaşdırılmış BC xərçəng şişi toxuması anbarı vasitəsilə əldə edilmişdir. BC Xərçəng Tədqiqatları Etika Komitəsi və Britaniya Kolumbiyası Universiteti (H07-00463) tərəfindən təsdiq edilmiş protokola əsasən, bütün xəstələrin nümunələri və klinik məlumatları məlumatlı yazılı razılıq almış və ya rəsmi olaraq razılıqlarından imtina etmişdir. Nümunələr sertifikatlaşdırılmış BioBankda (BRC-00290) saxlanılır. Xəstənin ətraflı xüsusiyyətləri S1 və S5 cədvəllərində göstərilmişdir. Kriokonservasiya üçün xəstənin şiş nümunəsini mexaniki olaraq parçalamaq və sonra tək hüceyrəli suspenziya əldə etmək üçün 100 mikronlu filtrdən keçirmək üçün skalpel istifadə olunur. Xəstənin assitləri hüceyrələri parçalamaq və supernatantı çıxarmaq üçün 4°C-də 10 dəqiqə ərzində 1500 dövr/dəq sürətlə santrifüj edilmişdir. Şiş və assitlərdən əldə edilən hüceyrələr 50% istiliklə inaktivləşdirilmiş insan AB serumunda (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) və 10% dimetil sulfoksiddə dondurulmuşdur. Bu konservləşdirilmiş tək hüceyrəli suspenziyalar əridilmiş və aşağıda təsvir edilən metabolomika və metabolitlərin təyini üçün istifadə edilmişdir.
Tam mühit 0,22 μm filtrlənmiş 50:50 nisbətində əlavə edilmiş RPMI 1640: AimV-dən ibarətdir. RPMI 1640 + 2,05 mM l-qlütamin (Thermo Fisher Scientific), 10% istiliklə inaktivləşdirilmiş insan AB serumu (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-qlütamin (Thermo Fisher Scientific), 1 x Penisilin Streptomisin (PenStrep) məhlulu (Thermo Fisher Scientific) və 50 μMB-merkaptoetanol ilə əlavə edilmişdir. AimV (Invitrogen) 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) və 2 mM l-qlütamin (Thermo Fisher Scientific) ilə əlavə edilmişdir. Axın sitometrinin boyama buferi, 3% istiliklə inaktivləşdirilmiş AB insan serumu (Sigma) ilə əlavə edilmiş 0,22 μm filtrlənmiş fosfat buferləşdirilmiş salin məhlulundan (PBS; Invitrogen) ibarət idi. Hüceyrə zənginləşdirmə buferi 0,22μm filtrlənmiş PBS-dən ibarətdir və 0,5% istiliklə inaktivləşdirilmiş insan AB serumu (Sigma-Aldrich) ilə tamamlanır.
37°C tam mühitdə hüceyrələr 30 dəqiqə ərzində 10 nM MT DR və 100 μM 2-NBDG ilə boyandı. Daha sonra hüceyrələr 4°C-də 15 dəqiqə ərzində canlılıq boyası eF506 ilə boyandı. Hüceyrələri FC Block (eBioscience) və Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences)-də yenidən suspenziya edin, axın sitometri boyama buferində durulaşdırın (istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq) və otaq temperaturunda 10 dəqiqə inkubasiya edin. Hüceyrələri 4°C-də 20 dəqiqə ərzində axın sitometri boyama buferində antikor dəsti (Cədvəl S2) ilə boyayin. Analizdən əvvəl hüceyrələri axın sitometri boyama buferində (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiqurasiyası) yenidən suspenziya edin. Hüceyrə sayı məlumatlarını təhlil etmək üçün SpectroFlo və FlowJo V10 istifadə edin və məlumatları yaratmaq üçün GraphPad Prism 8 istifadə edin. 2-NBDG və MT DR-nin orta flüoresans intensivliyi (MFI) loqarifmik olaraq normallaşdırıldı və sonra uyğun xəstələri nəzərə almaq üçün statistik təhlil üçün qoşalaşmış t testi istifadə edildi. 40-dan az hadisəsi olan bütün populyasiyaları təhlildən çıxarın; statistik təhlil və məlumatların vizuallaşdırılmasını aparmazdan əvvəl hər hansı mənfi dəyərlər üçün 1 MFI dəyərini daxil edin.
Yuxarıdakı proses panelinin əl ilə qapı strategiyasını tamamlamaq üçün, FlowJo-da ölü hüceyrələri aradan qaldırdıqdan sonra hüceyrələri populyasiyaya avtomatik olaraq təyin etmək üçün forma məhdudlaşdırma ağacının (FAUST) (21) tam annotasiyasından istifadə etdik. Səhv yerləşdirilmiş (PD1+ ilə PD1-şiş hüceyrələrinin birləşdirilməsi) və saxlanılan populyasiyaları birləşdirmək üçün çıxışı əl ilə idarə edirik. Hər nümunədə orta hesabla 2%-dən çox hüceyrə var, ümumilikdə 11 populyasiya.
PBMC-ni lökosit ayırma məhsullarından (STEMCELL Technologies) ayırmaq üçün Ficoll gradient sıxlıq santrifüqasiyası istifadə edilmişdir. CD8 + T hüceyrələri PBMC-dən CD8 MicroBeads (Miltenyi) istifadə edərək təcrid olunmuş və istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq 2 həftə ərzində TransAct (Miltenyi) istifadə edərək tam mühitdə genişləndirilmişdir. Hüceyrələr IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ehtiva edən tam mühitdə 5 gün saxlanılmış və sonra TransAct ilə yenidən stimullaşdırılmışdır. 7-ci gündə, istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq, hüceyrələri üç ardıcıl turda zənginləşdirmək üçün insan CD45 MicroBeads (Miltenyi) istifadə edilmişdir. Hüceyrələr axın sitometriyası təhlili üçün (yuxarıda təsvir edildiyi kimi) seçilmişdir və bir milyon hüceyrə LC-MS/MS təhlili üçün üç dəfə seçilmişdir. Nümunələr aşağıda təsvir edildiyi kimi LC-MS/MS ilə işlənmişdir. İtkin metabolit dəyərini 1000 ion sayı ilə qiymətləndirdik. Hər bir nümunə ümumi ion sayı (TİK) ilə normallaşdırılır, loqarifmik olaraq çevrilir və analizdən əvvəl MetaboAnalystR-də avtomatik olaraq normallaşdırılır.
Hər bir xəstənin tək hüceyrəli suspenziyası əridilib və 40 μm filtrdən keçərək tam mühitə süzülüb (yuxarıda təsvir edildiyi kimi). İstehsalçının protokoluna əsasən, CD8+, CD4+ və CD45-hüceyrələri üçün nümunələri (buz üzərində) zənginləşdirmək üçün MicroBeads (Miltenyi) istifadə edərək maqnit muncuq ayrılması ilə ardıcıl üç mərhələli müsbət seçim istifadə edilmişdir. Bir sözlə, hüceyrələr hüceyrə zənginləşdirmə buferində (yuxarıda təsvir edildiyi kimi) yenidən suspenziya edilir və sayılır. Hüceyrələr insan CD8 muncuqları, insan CD4 muncuqları və ya insan CD45 muncuqları (Miltenyi) ilə 4°C-də 15 dəqiqə inkubasiya edildi və sonra hüceyrə zənginləşdirmə buferi ilə yuyuldu. Nümunə LS sütunundan (Miltenyi) keçirilir və müsbət və mənfi fraksiyalar toplanır. Müddəti azaltmaq və hüceyrənin bərpası mərhələsini maksimum dərəcədə artırmaq üçün CD8 fraksiyası daha sonra CD4+ zənginləşdirməsinin ikinci mərhələsi üçün, CD4 fraksiyası isə sonrakı CD45 zənginləşdirməsi üçün istifadə olunur. Ayrılma prosesi boyunca məhlulu buz üzərində saxlayın.
Metabolit analizi üçün nümunələr hazırlamaq üçün hüceyrələr bir dəfə buz kimi soyuq duz məhlulu ilə yuyuldu və hər nümunəyə 1 ml 80% metanol əlavə edildi, sonra vorteks edildi və maye azotda donduruldu. Nümunələr üç dondurma-ərimə dövrünə məruz qaldı və 4°C-də 15 dəqiqə ərzində 14000 dövr/dəq sürətlə santrifüq edildi. Metabolitləri ehtiva edən supernatant quruyana qədər buxarlandı. Metabolitlər 50 μl 0,03% qarışqa turşusunda yenidən həll edildi, qarışdırılmaq üçün vorteks edildi və sonra qalıqları təmizləmək üçün santrifüq edildi.
Yuxarıda təsvir edildiyi kimi metabolitləri çıxarın. Metabolomika tədqiqatı üçün supernatantı yüksək performanslı maye xromatoqrafiya şüşəsinə köçürün. Partiya effektlərinin qarşısını almaq üçün hər nümunəni oxşar sayda hüceyrə ilə müalicə etmək üçün təsadüfi müalicə protokolundan istifadə edin. Əvvəllər AB SCIEX QTRAP 5500 Üçqat Dördqollu Kütlə Spektrometrində (50) dərc edilmiş qlobal metabolitlərin keyfiyyətcə qiymətləndirilməsini apardıq. Xromatoqrafik analiz və pik sahəsinin inteqrasiyası MultiQuant versiya 2.1 proqram təminatı (Applied Biosystems SCIEX) istifadə edilərək aparıldı.
İtkin metabolit dəyərini qiymətləndirmək üçün 1000 ion sayı istifadə edildi və hər bir nümunənin TIC-i nümunə emalından instrumental analiz tərəfindən daxil edilən dəyişiklikləri düzəltmək üçün hər bir aşkar edilmiş metabolitin normallaşdırılmış pik sahəsini hesablamaq üçün istifadə edildi. TIC normallaşdırıldıqdan sonra, loqarifmik çevrilmə və avtomatik norma xətti miqyası üçün MetaboAnalystR(51) (standart parametr) istifadə olunur. Nümunə növləri arasında metabolom fərqlərinin kəşfiyyat təhlili aparmaq üçün vegan R paketi ilə PCA-dan istifadə etdik və xəstələri təhlil etmək üçün qismən artıqlıq təhlilindən istifadə etdik. Nümunələr arasında Evklid məsafəsini qruplaşdırmaq üçün istilik xəritəsi dendroqramı qurmaq üçün Ward metodundan istifadə edin. Bütün hüceyrə növü və mikro mühit üzrə fərqli dərəcədə bol metabolitləri müəyyən etmək üçün standart metabolit bolluğu üzərində limma (52) istifadə etdik. İzahı sadələşdirmək üçün modeli müəyyən etmək üçün qrup orta parametrindən istifadə edirik və mikro mühitdəki hüceyrə növlərini hər qrup olaraq nəzərdən keçiririk (n = 6 qrup); Əhəmiyyət testi üçün hər metabolit üçün üç təkrar ölçmə apardıq. Yalançı replikasiyanın qarşısını almaq üçün xəstə limma dizaynında maneə kimi daxil edildi. Müxtəlif xəstələr arasında metabolitlərdəki fərqləri yoxlamaq üçün xəstələri əhatə edən limma modelini sabit bir şəkildə tənzimlədik. Hüceyrə növü ilə Padj <0.05 mikro mühiti arasındakı əvvəlcədən müəyyən edilmiş kontrastın əhəmiyyətini bildiririk (Benjamini-Hochberg korreksiyası).
Miltenyi Ölü Hüceyrə Təmizləmə Dəsti (>80% canlılıq) istifadə edərək canlılığı artırdıqdan sonra, 10x 5′gen ifadə protokolundan istifadə edərək ümumi canlı dondurulmuş assit və şiş nümunələri üzərində tək hüceyrəli transkriptom ardıcıllığı aparıldı. Uyğun şişlər və assitlər olan beş hal təhlil edildi, baxmayaraq ki, bir şiş nümunəsindən alınan aşağı canlılıq onun daxil edilməsinə mane oldu. Xəstələrin çoxsaylı seçimlərinə nail olmaq üçün hər bir xəstənin nümunələrini 10x xrom nəzarətçisinin zolaqlarında birləşdirdik və assitləri və şiş sahələrini ayrıca təhlil etdik. Ardıcıllıqla təyin edildikdən sonra [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp qoşalaşmış uc (PE), Kvebek genomu; Şiş və assit üçün hüceyrə başına orta hesabla 73.488 və 41.378 oxunuş]] üçün CellSNP və Vireo (53) istifadə etdik (CellSNP-yə əsasən). GRCh38 tərəfindən təmin edilən ümumi insan SNP-sinə (VCF) donor kimliyi təyin edilir. Xəstənin genotip statusunun (İBS) ən yaxın kimliyini (İBS) müəyyən etmək üçün SNPRelate-dən istifadə edirik, təyin olunmamış hüceyrələri və dupleks kimi müəyyən edilmiş hüceyrələri və assitlərlə şiş nümunələri arasında uyğun donorları istisna edirik (54). Bu tapşırığa əsasən, şişdə və assitdə bol hüceyrə təmsilçiliyi olan üç halı təhlil üçün saxladıq. Scater (55) və scran (56) BioConductor qablaşdırmasında kütlə filtrasiya addımını yerinə yetirdikdən sonra, təhlil üçün 6975 hüceyrə (müvafiq olaraq şiş və assitdən 2792 və 4183 hüceyrə) əldə etdik. Jaccard məsafəsinə əsaslanaraq paylaşılan ən yaxın qonşu şəbəkəsinin (SNN) igraph-ın (57) Louvain klasterizasiyasından istifadə edirik. ifadəyə görə klaster hüceyrələri. Klasterlər marker gen ifadəsinə əsaslanaraq ehtimal olunan hüceyrə tiplərinə əl ilə qeyd edildi və t-SNE ilə vizuallaşdırıldı. Sitotoksik T hüceyrələri, aşağı ribosomal zülal ifadəsinə malik altklasterlər istisna olmaqla, CD8A və GZMA ifadəsi ilə təyin olunur. İzar və digərlərinin (16) dərc olunmuş məlumatlarına, o cümlədən onların t-SNE yerləşdirilməsinə, immun hüceyrə markerləri ilə NNMT ifadəsi arasındakı ifadə üst-üstə düşməsini idarə edə biləcəyinə müraciət etdik.
PBMC-lər leykosit ayırma məhsullarından (STEMCELL Technologies) Ficoll qradiyent sıxlıq santrifüqasiyası ilə ayrıldı. CD3 + hüceyrələri CD3 muncuqlarından (Miltenyi) istifadə edərək PBMC-dən təcrid edildi. MNA-nın olması və ya olmaması halında, CD3 + hüceyrələri lövhəyə bağlı CD3 (5μq/ml), həll olan CD28 (3μq/ml) və IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ilə aktivləşdirildi. Genişlənmənin son günündə canlılıq (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) və proliferasiyası (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) axın sitometriyası ilə qiymətləndirildi. 4 saat ərzində GolgiStop ilə PMA (20 ng/ml) və ionomisin (1μg/ml) ilə hüceyrələri stimullaşdırmaqla effektor funksiyasını qiymətləndirin və CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) və TNFα-fluoresein izotiyosiyanat (FITC) (MAb11, BD) monitorinqini aparın. 4 saat ərzində qPCR və ChIP hüceyrələrini PMA (20 ng/ml) və ionomisin (1μg/ml) ilə stimullaşdırın. ELISA supernatantı 4 saat ərzində PMA (20 ng/ml) və ionomisin (1 μg/ml) ilə stimullaşdırmadan əvvəl və sonra toplanmışdır.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) istifadə edərək RNT-ni təcrid etmək üçün istehsalçının protokoluna əməl edin. Nümunəni homogenləşdirmək üçün QIAshredder (QIAGEN) istifadə edin. Tamamlayıcı DNT (cDNA) sintez etmək üçün yüksək tutumlu RNT-dən kDNA dəstinə (Thermo Fisher Scientific) istifadə edin. Aşağıdakı zondlarla gen ifadəsini (istehsalçının protokoluna uyğun olaraq) ölçmək üçün TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) istifadə edin: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [qliseraldehid-3-fosfat off Hidrogen (GAPDH)] və Hs01010726_m1 (SLC22A2). Nümunələr, MicroAmp optik filmi olan MicroAmp sürətli optik 96 quyulu reaksiya lövhəsində (Applied Biosystems) StepOnePlus real vaxt PCR sistemində (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) sınaqdan keçirildi. 35-i keçən hər hansı bir Ct dəyəri aşkarlama həddindən yuxarı hesab olunur və aşkarlanmayan kimi qeyd olunur.
Əvvəllər təsvir edildiyi kimi ChIP həyata keçirin (58). Bir sözlə, hüceyrələr formaldehidlə müalicə edildi (son konsentrasiyası 1,42%) və otaq temperaturunda 10 dəqiqə inkubasiya edildi. Əlavə şişkinlik buferindən (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl və 0,1% NP-40) buz üzərində 10 dəqiqə istifadə edin, sonra təsvir edildiyi kimi immunpresipitasiya buferində yenidən suspenziya edin (58). Daha sonra nümunə aşağıdakı dövrlərlə sonikasiya edildi: 10 dövr (20 1 saniyəlik impuls) və 40 saniyəlik statik vaxt. Nümunə ilə 4°CC temperaturda ChIP dərəcəli immunoglobulin G (Hüceyrə Siqnal Texnologiyası; 1μl), histon H3 (Hüceyrə Siqnal Texnologiyası; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) və SP1 (Hüceyrə Siqnal Texnologiyası; 3μl) antikorlarını gecə ərzində çalxalayın və 4°CC temperaturda inkubasiya edin. Nümunə ilə 4°C-də 1 saat ərzində yüngülcə silkələməklə A protein muncuqlarını (Thermo Fisher Scientific) inkubasiya edin, sonra DNT-ni zənginləşdirmək üçün chelex muncuqlarından (Bio-Rad) istifadə edin və zülalın həzmi üçün proteinaz K-dan (Thermo Fisher) istifadə edin. TNFα promotoru PCR ilə aşkar edildi: irəli, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; əksinə, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp məhsul). Təsvirlər Image Lab (Bio-Rad) tərəfindən istehsal edilmiş və ImageJ proqram təminatından istifadə edərək kəmiyyətləndirilmişdir.
Hüceyrə kulturası supernatantı yuxarıda təsvir edildiyi kimi toplanmışdır. Təyinat istehsalçının insan TNFα ELISA dəsti (Invitrogen), insan IL-2 ELISA dəsti (Invitrogen) və insan IFN-γ ELISA dəsti (Abcam) prosedurlarına uyğun olaraq aparılmışdır. İstehsalçının protokoluna əsasən, supernatant TNFα və IL-2-ni aşkar etmək üçün 1:100, IFN-γ-ni aşkar etmək üçün isə 1:3 nisbətində durulaşdırılmışdır. 450 nm-də absorbsiyanı ölçmək üçün EnVision 2104 Çoxetiketli Oxuyucudan (PerkinElmer) istifadə edin.
PBMC-lər leykosit ayırma məhsullarından (STEMCELL Technologies) Ficoll qradiyent sıxlıq santrifüqasiyası ilə ayrıldı. CD3 + hüceyrələri CD3 muncuqlarından (Miltenyi) istifadə edərək PBMC-dən təcrid edildi. MNA-nın olması və ya olmaması halında, CD3 + hüceyrələri lövhəyə bağlı CD3 (5μq/ml), həll olan CD28 (3μq/ml) və IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ilə 3 gün ərzində aktivləşdirildi. 3 gündən sonra hüceyrələr toplandı və 0,9% salin məhlulu ilə yuyuldu və pellet donduruldu. Hüceyrə sayı 123count eBeads istifadə edərək axın sitometriyası (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfiqurasiyası) ilə aparıldı.
Yuxarıda təsvir edildiyi kimi metabolitlərin çıxarılması. Qurudulmuş ekstrakt 4000 hüceyrə ekvivalenti/μl konsentrasiyasında bərpa edilmişdir. Nümunəni tərs fazalı xromatoqrafiya (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) və CORTECS T3 sütunu (2.1×150 mm, hissəcik ölçüsü 1.6-μm, məsamə ölçüsü 120-Å; #186008500, Waters) ilə təhlil edin. Elektrosprey ionlaşmasının müsbət rejimdə işlədiyi qütb kütlə spektrometri (6470, Agilent). Mobil A fazası 0.1% qarışqa turşusundan (H2O-da), mobil B fazası 90% asetonitrildən, 0.1% qarışqa turşusundan ibarətdir. LC qradiyenti 100% A üçün 0-dan 2 dəqiqəyə, 99% B üçün 2-dən 7.1 dəqiqəyə və 99% B üçün 7.1-dən 8 dəqiqəyə qədərdir. Daha sonra sütunu 3 dəqiqə ərzində 0.6 ml/dəq axın sürətində mobil A fazası ilə yenidən tarazlaşdırın. Axın sürəti 0.4 ml/dəq-dir və sütun kamerası 50°C-yə qədər qızdırılır. Saxlama müddətini (RT) və transformasiyanı (RT = 0.882 dəqiqə, transformasiya 1 = 137→94.1, transformasiya 2 = 137→92, Çevrilmə 3 = 137→78) təyin etmək üçün MNA-nın təmiz kimyəvi standartından (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) istifadə edin. Hər üç keçid düzgün saxlama vaxtında baş verdikdə, spesifikliyi təmin etmək üçün kəmiyyətləndirmə üçün keçid 1 istifadə olunur. MNA-nın (Toronto Tədqiqat Kimya Şirkəti) standart əyrisi, müvafiq olaraq 0,1, 1,0, 10 və 100 ng/ml və 1,0 və 10μq/ml maye standartlarını əldə etmək üçün əsas məhlulun (1 mq/ml) altı ardıcıl durulaşdırılması ilə yaradılmışdır. Aşkarlama həddi 1 ng/ml, xətti cavab isə 10 ng/ml ilə 10μq/ml arasındadır. LC/MS analizi üçün iki mikrolitr nümunə və standartın hər inyeksiyası istifadə olunur və analiz platformasının sabitliyini təmin etmək üçün hər səkkiz inyeksiyadan sonra qarışıq keyfiyyətə nəzarət nümunəsi aparılır. MNA ilə müalicə olunmuş bütün hüceyrə nümunələrinin MNA cavabları analizin xətti diapazonunda idi. Məlumatların təhlili MassHunter kəmiyyət analiz proqram təminatı (v9.0, Agilent) istifadə edilərək aparılmışdır.
İkinci nəsil αFR-CAR konstruksiyası Song və digərlərindən götürülmüşdür (59). Bir sözlə, konstruksiya aşağıdakı məzmunu ehtiva edir: CD8a lider ardıcıllığı, insan αFR-spesifik tək zəncirli dəyişən fraqment, CD8a menteşə və transmembran bölgəsi, CD27 hüceyrədaxili domeni və CD3z hüceyrədaxili domeni. Tam CAR ardıcıllığı GenScript tərəfindən sintez edilmiş və sonra transduksiya səmərəliliyini qiymətləndirmək üçün istifadə edilən GFP ifadə kasetinin yuxarı axınında ikinci nəsil lentiviral ifadə vektoruna klonlaşdırılmışdır.
Lentivirus HEK293T hüceyrələrinin transfeksiyası ilə istehsal olunur [Amerika Tipi Mədəniyyət Kolleksiyası (ATCC); Dulbecco-nun 10% döl mal-qara serumu (FBS) və 1% PenStrep ehtiva edən modifikasiya olunmuş Eagle mühitində yetişdirilir və CAR-GFP vektorundan istifadə olunur. Qablaşdırma plazmidləri (psPAX2 və pMD2.G, Addgene) lipofeksiya aminindən (Sigma-Aldrich) istifadə edir. Virus tərkibli supernatant transfeksiyadan 48 və 72 saat sonra toplanır, süzülür və ultrasentrifuqasiya ilə konsentratlaşdırılır. Konsentratlaşdırılmış viral supernatant transduksiyaya qədər -80°C-də saxlanılır.
PBMC-lər sağlam donor leykosit ayırma məhsullarından (STEMCELL Technologies) Ficoll qradiyent sıxlıq santrifüqasiyası ilə ayrılır. CD8+ hüceyrələrini PBMC-dən təcrid etmək üçün müsbət seleksiya CD8 mikromuncuqlarından (Miltenyi) istifadə edin. T hüceyrələrini TransAct (Miltenyi) və TexMACS mühitində stimullaşdırın [Miltenyi; 3% istiliklə inaktivləşdirilmiş insan serumu, 1% PenStrep və IL-2 (300 U/ml) ilə tamamlanır]. Stimullaşdırmadan iyirmi dörd saat sonra T hüceyrələri lentivirusla (106 hüceyrə üçün 10 μl konsentratlı virus supernatantı) transduksiya edildi. Cytek Aurora-da (FSC (İrəli Səpələnmə)/SSC (Yan Səpələnmə), Singlet, GFP+ üzərində) transduksiyadan 1-3 gün sonra, ən azı 30% transduksiya səmərəliliyini nümayiş etdirmək üçün hüceyrələrin GFP ifadəsini qiymətləndirin.
CAR-T hüceyrələri aşağıdakı şərtlər altında 24 saat ərzində Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep ilə əlavə edilmiş) mühitində becərildi: müalicə olunmamış, 250 μM adenozin və ya 10 mM MNA ilə işlənmişdir. Əvvəlcədən müalicədən sonra CAR-T hüceyrələri PBS ilə yuyulmuş və 10-da 10% FBS və 1% PenStrep ilə əlavə edilmiş 20.000 SK-OV-3 hüceyrəsi [ATCC; McCoy 5A mühitində (Sigma-Aldrich): 1 effektorun hədəfə nisbəti əlavə edilmiş Immunocult mühitində üçqat olaraq artırılmışdır. Digitalis saponin (0.5 mq/ml; Sigma-Aldrich) ilə lizis edilmiş SK-OV-3 hüceyrələri və SK-OV-3 hüceyrələri müvafiq olaraq mənfi və müsbət nəzarət qrupları kimi istifadə edilmişdir. 24 saatlıq birgə becərilmədən sonra supernatant toplandı və laktat dehidrogenaza (LDH) istehsalçının təlimatlarına (LDH Glo Sitotoksiklik Təhlili Dəsti, Promega) uyğun olaraq ölçüldü. LDH supernatantı LDH buferində 1:50 nisbətində durulaşdırıldı. Öldürmə faizi aşağıdakı düsturla ölçüldü: öldürmə faizi = korreksiya faizi / maksimum öldürmə nisbəti x 100%, burada korreksiya faizi = yalnız birgə becərilmə-T hüceyrələri və maksimum öldürmə nisbəti = müsbət nəzarət-mənfi nəzarət.
Mətndə və ya materiallarda və metodlarda təsvir edildiyi kimi, statistik təhlil üçün GraphPad Prism 8, Microsoft Excel və ya R v3.6.0 istifadə edin. Eyni xəstədən birdən çox nümunə toplanarsa (məsələn, assit və şiş), qoşalaşmış t testindən istifadə edirik və ya xəstəni təsadüfi təsir kimi xətti və ya ümumiləşdirilmiş modelə daxil edirik. Metabolomika təhlili üçün əhəmiyyət testi üçqat nüsxədə aparılır.
Bu məqalə üçün əlavə materiallar üçün http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 linkinə baxın.
Bu, son istifadənin kommersiya məqsədi daşımadığı və orijinal əsərin düzgün olması şərtilə istənilən mühitdə istifadəyə, yayılmağa və çoxaldılmasına icazə verən Creative Commons Attribution-Qeyri-Kommersiya Lisenziyasının şərtləri altında paylanan açıq girişli məqalədir. İstinad.
Qeyd: Səhifəyə tövsiyə etdiyiniz şəxsin e-poçtu görməsini istədiyinizi və spam olmadığını bilməsi üçün yalnız e-poçt ünvanınızı təqdim etməyinizi xahiş edirik. Heç bir e-poçt ünvanını qeyd etməyəcəyik.
Bu sual, ziyarətçi olub-olmadığınızı yoxlamaq və avtomatik spam göndərilməsinin qarşısını almaq üçün istifadə olunur.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Con Stagg (Con Stagg), Bred H. Nelson (Brad H. J.Rph Delson), Rallar DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA, T hüceyrələrinin immun sisteminin zəifləməsinə kömək edir və insan xərçənginin müalicəsi üçün potensial immunoterapiya hədəfini təmsil edir.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Con Stagg (Con Stagg), Bred H. Nelson (Brad H. J.Rph Delson), Rallar DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA, T hüceyrələrinin immun sisteminin zəifləməsinə kömək edir və insan xərçənginin müalicəsi üçün potensial immunoterapiya hədəfini təmsil edir.
©2021 Amerika Elmin İnkişafı Assosiasiyası. bütün hüquqlar qorunur. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef və COUNTER-ın tərəfdaşıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.